Mus

Alle dyreprocedurer og alt arbejde med mus er godkendt af Komitéen for Dyrepleje og -anvendelse ved Kinas Landbrugsuniversitet (Tilladelsesnummer: SKLAB-2016-01-04). CD1- og 129-mus blev opnået fra Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Actin-GFP-mus blev opnået fra Shaorong Gaos laboratorium i Tongji University. Alle mus blev holdt under specifikke patogenfrie (SPF) forhold med en 12-timers mørke/ 12-timers lyscyklus mellem 06:00 og 18:00 i et temperaturkontrolleret rum (22 ± 2 °C) med fri adgang til vand og mad.

Stemcellelinjer og cellekultur

G4 og G4-ACTB-DsRed-MST ESC’er blev indhentet fra Dr. Andras Nagy, Kristina Vintersten og Marina Gertsensteins laboratorium i Mount Sinai Hospital & Samuel Lunemfeld Research Institute. Blimp1-mVenus og Stella-ECFP (BVSC) dobbelttransgene ESC-linje, der udtrykker membranmålrettet Venus (mVenus) under kontrol af Prdm1 (Blimp1) reguleringselementer og forbedret CFP (ECFP) under kontrol af Dppa3 (Stella/Pgc7), blev opnået fra Dr. Mitinori Saitou45,46.

Til generering af Lefty1-mCherry-mus XEN-cellinjen for mus blev Lefty1-promotoren og det fluorescerende protein integreret i XEN-celler ved hjælp af Sleeping Beauty-transposonsystemet, som består af to komponenter: transposonvektoren modificeret fra pT2/LTR7-GFP (addgene #62541) og transposasevektoren (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879). PT2/LTR7-GFP blev tilføjet med “puro”-kaster, som kunne udtrykke puromycin N-acetyltransferase, og GFP CDS-regionen blev erstattet med mCherry. DNA-fragmentet, som blev amplificeret fra pT2/LTR7-GFP ved hjælp af primeren PT2-F (GTTTGGACACAAACCACAACTATAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACACATCATCATTTTCTG), blev koblet med “puro” castle og mCherry CDS-regionen for at opnå vektoren med navnet PT2-Puro-mCherry ved hjælp af NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs). Promotorsekvensen af Lefty1-genet blev amplificeret fra DNA fra ES-musceller ved hjælp af Lefty1-F (GTCCGGTGGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTCTTGAGGAGTCTCTGCGG). Derefter blev promotorsekvensen af Lefty1-genet tilføjet til PT2-Puro-mCherry ved hjælp af NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs), hvor PT2-Puro-mCherry blev lineariseret med EcoRI, og overlapsekvensen, der indeholder EcoRI-sekvensen, blev tilføjet til promotorsekvensen af Lefty1-genet. Vektoren fik navnet PT2-Puro-mCherry-Lefty1. Derefter blev PT2-Puro-mCherry-Lefty1 og pCMV(CAT)T7-SB100 transficeret i XEN-celler fra mus og screenet med 2 μg pr. mL puromycin med henblik på efterfølgende analyser.

Til fremstilling af Lamc1 (laminin, gamma 1)-knockoutcellelinjer blev der anvendt to sgRNA-sekvenser (GGAGTACTGCTGCGTGCAGCAGACTGGGGGG og GCTTTGCCACCAGGTGGGGTGTCGG), der er rettet mod Lamc1’s exon1, til fremstilling af en dobbelt sgRNA-vektor. Fragmenter indeholdende to sgRNA-sekvenser blev amplificeret fra PUC-U6-sgRNA-Kana (fra Huang Xingxu lab) ved hjælp af primere (Lamc1sg1-F: atgcgtctctcacaccggagtactgcgtggcagactggttggttagtagagctactagaaatagcaag og Lamc1sg2-R: atgcgtctcgaaacacaccacctggtggggcaaagcggtgttgtttcgtcctcctttccacaag). PCR-produktet blev fordøjet med BsmbI og ligeret med lineariseret PX330-GFP. Vektorerne er blevet transficeret i henholdsvis ESC’er og XENC’er ved hjælp af Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Derefter blev GFP-positive celler sorteret ved hjælp af flowcytometri og fortyndet med henblik på monoklonal vækst. DNA blev ekstraheret fra de opnåede monoklonale celler og blev underkastet PCR-amplifikation og sekventering. Knockout-positive celler blev udvalgt til opfølgningsforsøg.

Til generering af Nodal knockout-cellelinjer blev gRNA-sekvenser målrettet (GCCCTCGTCACACCGTCTCCCCTCCTCTGG) Nodals exon1 anvendt til konstruktion af sgRNA-vektor. Primere til Nodal sgRNA (Nodal-sgF: caccgccctcgtcaccgtcccctc og Nodal-sgR: aaacgaggggacgacggtgacgagggc) blev annealeret, og det annealerede produkt blev ligeret til lineariseret PX330-GFP ved hjælp af BbsI. Vektorerne er blevet transficeret i ESC’er ved hjælp af Lipofectamine 3000, og GFP-positive celler blev sorteret ved hjælp af flowcytometri og fortyndet med henblik på monoklonal vækst. DNA blev ekstraheret fra de opnåede monoklonale celler og blev underkastet PCR-amplifikation og sekventering. Knockout-positive celler blev udvalgt til opfølgende eksperimenter.

Til generering af p53 knockout ESC-linje blev sgRNA-sekvensen til p53-mutation klonet ind i PX330-GFP-vektoren (addgene, #48138) ved hjælp af CRISPR-Cas9-systemet59. Vektoren blev transficeret i G4 ESC’er ved hjælp af Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Tre dage efter transfektion blev GFP-positive celler sorteret og udplottet på en 6-hulsplade. Kolonier blev plukket, og knockout-regionerne blev amplificeret ved PCR ved hjælp af primere (F: CATCCAGGGCGGGGAAATAGAGAGAC; R: CCTGACTGTGTGTGTAAACTAGGC) og sekventeret. Ved at tilpasse med wild-type sekvensen blev homozygote knockout cellekolonier identificeret og udvalgt til yderligere undersøgelse.

ESC’er blev dyrket i Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) med 15% (v/v) FBS (Gibco, ES celle kvalificeret), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM ikke-essentielle aminosyrer (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natriumpyruvat (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1000 IU LIF (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM PD0325901 (4423, Tocris), og 3 µM CHIR99021 (4192, Tocris). ESC’er blev dyrket ved 37 °C og 5 % CO2 på gelatiniserede og feeder-dækkede vævskulturkvalitets brøndplader og passeret, når 80 % konfluens er opnået.

TSC’er blev afledt af E3,5 blastocyster, der blev skyllet fra livmoderen af 5-ugers gamle hun-CD1-mus15,60. Blastocysterne blev dyrket på mitotisk inaktiverede mus MEF-celler (feederceller) med TSC-kulturmedium: avanceret RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) suppleret med 20 % (v/v) FBS (Gibco, ES-cellekvalificeret), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natriumpyruvat (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% (v/v) penicillin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng pr. mL rekombinant humant FGF4 (235-F4-025, R&D) og 1 µg pr. mL heparin (07980, Stem Cell). Indtil udvæksten blev dannet på dag 4, blev de efterfølgende disaggregeret ved inkubation i 0,1 % trypsin-EDTA i 5 min i inkubatoren. Der tilsættes frisk mus 70% embryonale fibroblast-konditioneret medium indeholdende FGF4 og heparin for at stoppe reaktionen og tilbageføres til inkubatoren. Mediet udskiftes hver anden dag, indtil TS-cellekolonier kan observeres, og mediet udskiftes med TSC-kulturmedium for at vedligeholde cellerne. TSC-EGFP-eksprimerende EGFP-cellelinjer (TSC-EGFP) blev afledt af wild-type TSC’er, som blev transficeret med PB-UBC-EGFP-vektoren ved hjælp af JetPrime (114-15, Polyplus-transfektion). TSC’er blev dyrket ved 37 °C og 5 % CO2 på en gelatiniseret og feeder-dækket vævskulturplade og passeret, når 80 % konfluens er opnået. Kulturmediet blev skiftet dagligt.

XENC’er blev udledt af E3,5-blastocyster, der blev skyllet ud af livmoderen på en 5-ugers gammel hunmus af hankøn 129 under anvendelse af modificerede XENC-betingelser61. Museblastocyster blev dyrket på feederceller, indtil de dannede en udvækst på dag 4, som efterfølgende blev disaggregeret ved inkubation i 0,1 % trypsin-EDTA i 5 minutter i inkubatoren. Der tilsættes frisk mus ES-cellemedium uden PD0325901 og CHIR99021 for at stoppe reaktionen, og mediet udskiftes hver anden dag, indtil der kan observeres XEN-cellekolonier. XEN-cellekolonier blev vedligeholdt med standard XEN-medium: avanceret RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) suppleret med 15 % (v/v) FBS (Gibco) og 0,1 mM β-mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 % penicillin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific). XENC-EGFP-cellinjen blev afledt direkte fra Actin-EGFP-museblastocysten. Til foderfri dyrkning blev XENC’erne holdt på en brøndplade af vævskulturkvalitet belagt med gelatine. XENC-cellerne blev dyrket ved 37 °C og 5 % CO2. De blev passeret, når de nåede 90 % konfluens. Kulturmediet blev skiftet dagligt.

Generering af selvsamlede embryoner

ESC’er, som nåede 80 % konfluens, blev vasket én gang med PBS (14190-094, Gibco) og blev inkuberet i 5 min. ved 37 °C i TrypLE (12605010, Thermo Fisher Scientific). TSC’er og XENC’er blev dissocieret til enkeltceller ved inkubation med 0,1 % trypsin-EDTA (25300054, Thermo Fisher Scientific) ved 37 °C. Cellerne blev pelleteret ved centrifugering ved 1000 rpm i 5 minutter. Pelleten blev re-suspenderet i rekonstrueret embryomedium ved at pipettere til enkeltceller. Cellerne blev automatisk optalt med en automatisk celletæller.

For ETX-embryoider blandes ESC’er, TSC’er og XNEC’er med et celletal på henholdsvis 1 × 105, 1 × 105 og 2 × 105 (for ETS-embryoider blandes ESC’er og TSC’er med et celletal på henholdsvis 1 × 105 og 1 × 105); for EXE-embryoider blandes ESC’er og XENC’er med et celleantal på henholdsvis 1 × 105 og 1 × 105) med 2 mL rekonstrueret embryomedium pr. 35 mm ubehandlet cellekulturskål. Flyt skålen på de horisontale rotatorer ved 37 °C, 5 % CO2 og 100 % luftfugtighed. Rotationshastigheden er 60 rpm pr. minut. Det rekonstruerede embryomedium indeholder 39 % avanceret RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) og 39 % DMEM (11960069, Thermo Fisher Scientific) som supplement med 17,5 % FBS (Gibco, ES-cellekvalificeret), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM MEM ikke-essentielle aminosyrer (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natriumpyruvat (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1 % penicillin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific). Mediet skiftedes med 2 mL frisk rekonstrueret embryomedium hver dag.

EXE-embryoider dannes konsekvent og effektivt, de funktionelle eksperimenter kan udføres uden udvælgelse af regelmæssige eller uregelmæssige strukturer. Til de funktionelle eksperimenter med ETX-embryoider og ETS-embryoider valgte vi de regelmæssige strukturer baseret på deres morfologi og de passende proportioner og positioner af ESC- og TSC-kompartmenter ved indikation af TSC-EGFP under stereofluorescensmikroskopet.

Vildtypeembryoindsamling og in vitro-kultur

Blastocyster blev indvundet fra E4,5 superovulerede drægtige hunmus ved uterinskylning med M2 (MR-015-D, Millipore). Embryoner blev dyrket i IVC-medium efter fjernelse af den murale trophectoderm in vitro på μ-slides med 8 brønde (80826, Ibidi)62. Til udvinding af E5,5-, E5,75- og E6,5-embryoner beskrives dissektion af decidua fra livmoderen i overensstemmelse med den rapporterede protokol63. Til EPI-explantater fra CD1-mus blev dissekeret på dag E5,0 som tidligere rapporteret28 og dyrket med ETX-embryoider-medium in vitro.

Immunofluorescensfarvning

Musembryoner og rekonstruerede embryoner blev fikseret med 4 % paraformaldehyd (DingGuo, AR-0211) ved 4 °C i 20 minutter og vasket tre gange med en vaskebuffer (PBS indeholdende 0,1 % Tween-20). Derefter blev embryonerne permeabiliseret med 0,5 % Triton X-100 (H5142, Promega) i 30 min. ved stuetemperatur og blev inkuberet med primære antistoffer i blokeringsbuffer (3 % BSA, 0,3 % Triton X-100) natten over ved 4 °C. Efter vask for at fjerne ubundne primære antistoffer blev cellerne inkuberet med sekundært antistof i blokeringsbuffer natten over ved 4 °C. Cellekernen blev farvet med DAPI, efterfulgt af to gange vask med vaskebuffer, hvorefter den blev monteret i Fluoroshield Mounting Medium med DAPI (104140, abcam). Billeder blev optaget med et Nikon A1 konfokalt mikroskop.

Billeder med behandling og analyse

Billeder for museembryoner og rekonstruerede embryoner blev optaget ved hjælp af et Nikon A1 konfokalt mikroskop med et 20 × eller 40 × objektiv. Alle analyser blev udført ved hjælp af billedanalysesoftware med åben kildekode ”Fiji”. Vævets volumen og celletal for rekonstruerede embryoner og wild-type embryoner blev vurderet, og immunofluorescensintensitetsmålinger til PCX-fordelingsanalyse blev også udført ved hjælp af Fiji-software9.

High-throughput single-cell qPCR og databehandling

Til isolering af single-celler blev visse celler på forskellige udviklingsstadier (0, 24 og 84 timer) indsamlet fra to typer ETX-embryoider, som blev rekonstrueret med henholdsvis Lefty1-mCherry XENC (LC-ETX-embryoider) og BVSC ESC (BVSC-ETX-embryoider) reportercellelinjer. For at isolere de enkelte celler udvælger vi kun LC-ETX-embryoiderne med DVE/AVE-lignende væv identificeret ved asymmetrisk udtryk af mCherry-proteinerne og udvælger BVSC-ETX-embryoiderne med asymmetrisk udtryk af mVenus-proteinerne i ESC-kompartmentet nær grænsen mellem ESC- og TSC-kompartmentet. For LC-ETX-embryoider blev der indsamlet 0, 24 og 84 timers LC-negative ESC-afledte celler (LC- XEN) samt 84 timers positive ESC’er (BVSC+ ES) fra den modsatte side af LC- XEN. For BVSC-ETX-embryoider blev der indsamlet 0, 24 og 84 timers BV-negative ESC-afledte celler (BVSC- ES) samt 84 timers positive ESC’er (BVSC+ ES) fra den modsatte side af BVSC- ES. Desuden blev enkeltceller fra TSC-kompartmenter i ETX-embryoiderne samlet med BVSC-ESC’er ved 0, 24 og 84 h indsamlet baseret på EGFP-reporter.

Til enkeltcelleseparation blev alle ETX-embryoider inkuberet i 0,1% trypsin-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, USA) i 5 min. ved 37 °C og derefter overført til M2-medium (MR-015-D, Millipore). Efter forsigtig gentagen mundpipettering flere gange blev enkeltceller isoleret med en fint trukket glasspids. I gennemsnit blev der indsamlet 30-40 celler for hver type. Hver celle blev vasket tre gange i Dulbecco’s fosfatbufferet saltvand (Invitrogen, Carlsbad, USA) indeholdende 0,1 % BSA (Sigma-Aldrich, MO, USA) og anbragt i mastermix til omvendt transskription-polymerasekædereaktion (RT-PCR) til lysis, sekvensspecifik omvendt transskription og præamplifikation, som beskrevet i tidligere rapport64.

Til design og validering af primere blev der anvendt gener, som regulerer celleliniedifferentiering (hovedsagelig fra E3,5 til E6,5 stadiet) og deltager i dominerende signalveje (f.eks, Wnt, Nodal-signalvej) blev udvalgt i overensstemmelse med embryogenese af mus. mRNA-sekvenserne for hvert interesseret gen blev hentet fra NCBI, og der blev kun anvendt fælles regioner for gener med forskellige transskriptioner. Gen-specifikke qRT-primere blev designet med Primer3-softwaren inden for en længde på 100-250 bp. Alle primere var blevet testet ved hjælp af cDNA fra museembryoner (blanding af E5,5 og E6,5) med henblik på amplifikationseffektivitet og specificitet (anført i supplerende data 1).

Single-celle sekvensspecifik præamplifikation svarende til tidligere rapport65. I alt 96 primersæt blev sammenlagt til en slutkoncentration på 0,1 μM for hver primer. Individuelle celler isoleret fra embryoner blev overført til sterile mikrorør fyldt med 5 μL RT-PCR-mastermix indeholdende 2,5 μL CellsDirect-reaktionsmix (Invitrogen, Carlsbad, USA), 0,5 μL primerpulje, 0,1 μL RT/Taq-enzym (Invitrogen, Carlsbad, USA) og 1,9 μL nucleasefrit vand (Invitrogen, Carlsbad, USA) i hvert rør. Rørene blev straks frosset ned på tøris. Efter en kort centrifugering ved 4 °C blev rørene straks anbragt i PCR-maskinen. Cellelyses og sekvensspecifikke reverse transkriptioner blev udført ved 50 °C i 1 time. Derefter blev reverse transkriptase inaktiveret og Taq-polymerase aktiveret ved opvarmning til 95 °C i 3 minutter. Efterfølgende gennemgik cDNA i samme rør 20 cyklusser med sekvensspecifik amplifikation ved denaturering ved 95 °C i 15 s og annealing og elongation ved 60 °C i 15 min. For at undgå fordampning blev de resulterende produkter opbevaret ved -80 °C.

Til kvantitativ PCR med høj gennemstrømning af mikrofluidisk enkeltcelle-PCR blev alle præamplificerede cDNA-produkter valideret af realtids-PCR-systemet (ABI 7500) ved hjælp af det endogene kontrolgen Actinb, og kun tærskelværdi (Ct) inden for 9 til 12 blev udvalgt til efterfølgende forsøg. Amplificerede enkeltcelleprøver blev analyseret med SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX (Bio-Rad, Californien, USA) og individuelle qPCR-primere i 96 × 96 dynamiske arrays på et Biomark System (Fluidigm, San Francisco, USA). Ct-værdiberegningen blev udført med BioMark Real-Time PCR Analysis software (Fluidigm, San Francisco, USA).

For Single-Cell Data Processing and Visualization blev alle rå Ct-værdier opnået fra BioMark Systemet konverteret til Log2 relative ekspressionsniveauer ved at trække værdierne fra den antagne baggrunds-Ct-værdi på 26. Prøver med lav eller fraværende ekspression af endogene kontrolgener (Actinb og Gapdh) blev udelukket fra efterfølgende analyser. PLS-DA blev anvendt på ekspressionsdataene for at skelne mellem cellegrupper i forskellige ETX-embryoider med R-pakken mixOmics66. Hierarkisk clustering blev udført ved hjælp af euklidiske afstande, og dendrogrammer blev vist langs de rækkeskalerede heatmaps ved hjælp af fluidigmSC-pakken. Box-plots og violinplots blev genereret med origin 8.6 og R-softwaren.

BVSC ESC-Chimeric embryoproduktion

Vi producerede BVSC ESC-Chimeric embryoner ved 8-cellet embryoinjektionsmetode ved hjælp af Piezo Micromanipulation67. For at sikre, at værtsembryonerne blev injiceret før komprimering, indsamlede vi embryonerne på tocellestadiet og dyrkede dem in vitro. For at opnå tocellede embryoner blev 5-ugers gamle hunmus superovuleret ved intraperitoneal injektion af fem internationale enheder (IE) PMSG, efterfulgt af 5 IE HCG 46-48 timer senere, og parret med hanmus. Embryoner i tocellestadiet blev indsamlet ved at skylle oviduktet med M2 ved E1,5. Embryoner blev vasket i M2 (MR-015-D, Millipore) og derefter overført til 10 μL KSOM-dråber (MR-020P-5F, Millipore) dækket med mineralolie på en vævskulturskål. Embryoerne blev holdt ved 37 °C med 5 % CO2 i et inkubator.

Omkring 15 ES-celler blev injiceret i embryoner i 8-celle-stadiet ved hjælp af Piezo Micromanipulation67,68. Otte uger gamle CD1-hunner parret med vasectomerede hanner blev anvendt som pseudodrætige mus. Injicerede blastocyster blev overført til livmoderen hos pseudopregnante hunner 2,5 dage post coitum (dpc). Embryoner på morula-stadiet med injicerede ESC’er blev overført til æggelederen hos recipienter med 0,5 dpc. Og vi overførte 14-16 embryoner pr. recipient. Ved E6,5 indsamlede vi de kimære embryoner fra deciduae som beskrevet ovenfor.

Embryooverførsel og evaluering af implantation

Otte uger gamle CD1-hunner parret med vasektomiserede hanner blev brugt som pseudodrætige mus. For rekonstruerede embryoner blev 36 timers rekonstruerede kugler (ETX-, ETS- og EXE-embryoider) overført til livmoderhornene på pseudopregnante recipient-CD1-hunmus ved 2,5 dpc eller 3,5 dpc. Der blev overført 16 til 20 embryoner pr. recipient. Implantationsstederne på dag 6,5 blev identificeret og talt ved intravenøs injektion af 100 μL 1 % Chicago Sky Blue-opløsning. Længden og radius af hver decidua blev målt ved hjælp af billedanalysesoftware, og volumenet blev beregnet ud fra disse målinger som V = πr2l.

HE-farvning og immunfarvning af implantationssteder

For at undersøge udviklingspotentialet af selvsamlede embryoner indsamlede vi decidua fra forskellige stadier, herunder 48, 72 og 84 h efter transplantation. Disse rekonstruerede (ETX, EXE og ETS) embryonprøver blev fikseret med 4 % paraformaldehyd i en nat ved 4 °C, dehydreret med gradientalkoholer, overført til xylen og indlejret i paraffin. Vi brugte E5,5, E6,0 og E6,5 vild-typeembryoner som kontrol. Prøverne blev skåret i 5 μm tykkelse, farvet med hæmatoxylin og eosin og observeret under et mikroskop. Deparaffiniserede rehydrerede prøver blev underkastet varmeinduceret epitope retrieval i citratbuffer ved ca. 95 °C ved en mikrobølgeovn i 10 min, hvorefter de blev afkølet til stuetemperatur og skyllet to gange i PBS med 3 min ved to gange. Permeabilisering blev udført med 0,5 % Triton X-100 i PBS i 20 min ved stuetemperatur. Efter permeabiliseringen blev prøverne skyllet i PBS tre gange (3 min. hver). Derefter blev prøverne blokeret i 30 min. med 5 % bovin serumalbumin (BSA) i PBS og inkuberet med primære antistoffer mod kanin anti-CK (ab9377, Abcam), kanin anti-COX2 (ab15191, Abcam), kanin anti-Laminin (L9393, Sigma), ged anti-Gata4 (sc-1237, Santa Cruz) eller mus anti-PL1 (sc-376436, Santa Cruz) ved 4 °C natten over. Den følgende dag blev skiverne vasket tre gange i PBS i 5 min. og inkuberet med sekundært antistof i 30 min. ved 37 °C. Sekundære antistoffer blev mærket med Alexa Fluorophore 488 eller 594 (Invitrogen). Efterfølgende blev snittene skyllet seks gange i PBS med 5 min hver og monteret med Fluoroshield-monteringsmedium med DAPI (ab104140, Abcam). Objektglassene blev opbevaret ved -20 °C, indtil de blev observeret. Billeder blev optaget med et Leica fluorescensmikroskop.

In situ-hybridisering

In situ-hybridisering med digoxygenin (DIG) blev udført på kryosektioner52. Der blev anvendt musespecifikke cRNA-sonder til Dtprp til hybridisering. Sektioner, der blev hybridiseret med sense-prober, tjente som negative kontroller. Frosne sektioner (8-10 μm) blev klæbet fast på poly-l-lysinbelagte objektglas (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, Kina) og opbevaret ved -80 °C indtil brug. Sektionerne blev anbragt på en glidevarmer (37 °C) i 2 min. og derefter rehydreret i PBS, postfikseret i 4 % PFA i 15 min. ved 4 °C, behandlet med proteinase K (15 μg pr. mL i 5 min. ved stuetemperatur), 0,25 % acetyleret i 10 min. og hybridiseret med DIG-mærkede sonder natten over ved 65 °C. Der blev foretaget to vaskninger efter hybridisering ved 65 °C efterfulgt af to vaskninger i 1 × MABT og 30 min RNase-behandling (20 μg pr. mL) ved 37 °C. Sektionerne blev blokeret i 1 time og inkuberet natten over i blok med anti-DIG-antistof (1:2500, Sigma-Aldrich). Efter vask blev farven udviklet med NBT/BCIP, indtil et brunt udfældningspræcipitat blev synligt. Objekttrådene blev modfarvet med nuclear fast red, dehydreret og klaret i xylen og monteret i cytoseal-monteringsmedium. Fotografier blev taget straks, før INT/BCIP-præcipitatet falmede.

Genotypeidentifikation af de overførte selvsamlede embryoner

Genomisk DNA blev ekstraheret fra DsRed-ESC’er, EGFP-TSC’er og ETX-embryoider isoleret fra decidua-vævet ved hjælp af et TIANamp Micro DNA Kit (DP316, Tiangen) i henhold til producentens instruktioner. Det diagnostiske primersæt EGFP (5ʹ-AGGACGTCATATCAAGGAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATATAGTCTTCTTCTTCTG-3ʹ) og DsRed (5ʹ-GTGCTTCAGCCGCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCTCACACCTCTTGATGCCGCCGTTCTTCT-3ʹ) blev anvendt til at identificere cellernes og prøvernes region ved PCR. Den termiske profil var 95 °C i 5 min, 35 cyklusser på 95 °C i 30 s, 60 °C i 30 s og 72 °C i 20 eller 40 s og en sidste cyklus ved 72 °C i 5 min.

Statistik

Statistiske analyser blev behandlet på GraphPad Prism 7.0-software (GraphPad Software, La Jolla, CA) til Windows (herunder enkeltcelle-Log2-ekspressionsdata). Data var blevet kontrolleret for normal fordeling og lige varianser med F-test, før hver parametrisk statistisk test blev udført. Hvor det var relevant, blev der udført tosidede Student’s t-tests med Welch’s korrektion, hvis variansen mellem grupperne ikke var lige stor. Fejlstænger repræsenterer standardfejl af s.e.m. eller s.d. som angivet. Figurens billedtekst angiver antallet af uafhængige eksperimenter, der er udført i hver analyse. Hvert forsøg var blevet gentaget for at sikre reproducerbarhed.

Tvævvolumen (fig. 1i og 7c og supplerende fig. 4h), procentvis beregning og beregning af antal (fig. 2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m og 7n; supplerende fig. 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a og 12g) blev bestemt ved hjælp af Excel. Signifikansanalysen blev udført ved hjælp af t-test ved hjælp af GraphPad Prism. Søjlediagrammer blev tegnet af Excel og GraphPad Prism, og scatterplots blev plottet ved hjælp af GraphPad Prism.

Rapporteringsresumé

Flere oplysninger om eksperimentelt design er tilgængelige i Nature Research Reporting Summary, der er linket til denne artikel.