topi

Tutte le procedure degli animali e tutto il lavoro del mouse sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato uso della China Agriculture University (Permesso numero: SKLAB-2016-01-04). I topi CD1 e 129 sono stati ottenuti da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. I topi Actin-GFP sono stati ottenuti dal laboratorio di Shaorong Gao della Tongji University. Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni di assenza di patogeni specifici (SPF) con un ciclo di 12 ore di buio / 12 ore di luce tra 06:00 e 18:00 in una stanza a temperatura controllata (22 ± 2 ° C) con libero accesso ad acqua e cibo.

Le linee cellulari staminali e la cultura cellulare

G4 e G4-ACTB-DsRed-MST ESCs sono state ottenute dal Dr. Andras Nagy, Kristina Vintersten e Marina Gertsenstein’s Laboratory nel Mount Sinai Hospital & il Samuel Lunemfeld Research Institute. Blimp1-mVenus e Stella-ECFP (BVSC) doppia linea di ESC transgeniche, che esprimono Venere (mVenus) sotto il controllo di elementi regolatori Prdm1 (Blimp1) e CFP potenziata (ECFP) sotto il controllo di Dppa3 (Stella/Pgc7), sono stati ottenuti dal Dr. Mitinori Saitou45,46.

Per la generazione di Lefty1-mCherry linea cellulare di topo XEN, il promotore Lefty1 e la proteina fluorescente sono stati utilizzati per integrare in cellule XEN dal sistema di trasposone Sleeping Beauty, che consiste di due componenti: il vettore trasposone modificato da pT2/LTR7-GFP (addgene # 62541) e il vettore trasposasi (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879). PT2/LTR7-GFP è stato aggiunto con il castello “puro”, che potrebbe esprimere la puromicina N-acetiltransferasi e la regione CDS GFP è stata sostituita da mCherry. Il frammento di DNA, che è stato amplificato da pT2/LTR7-GFP dal primer PT2-F (GTTTGGACAAACCACAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACATCATTTTCTG), accoppiato con “puro” castello e mCherry regione CDS per acquisire il vettore denominato PT2-Puro-mCherry utilizzando NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs). La sequenza del promotore del gene Lefty1 è stata amplificata dal DNA delle cellule ES del topo usando Lefty1-F (GTCCGGTGGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTTGAGTCTGCGG). Poi la sequenza del promotore del gene Lefty1 è stata aggiunta a PT2-Puro-mCherry da NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs), in cui PT2-Puro-mCherry è stato linearizzato da EcoRI e la sequenza di sovrapposizione contenente la sequenza EcoRI è stata aggiunta alla sequenza del promotore del gene Lefty1. Il vettore è stato chiamato PT2-Puro-mCherry-Lefty1. Poi PT2-Puro-mCherry-Lefty1 e pCMV(CAT)T7-SB100 sono stati trasfettati in cellule XEN di topo e schermati con 2 μg per mL di puromicina per le analisi successive.

Per la generazione di Lamc1 (laminina, gamma 1) linee cellulari knockout, due sequenza sgRNA targeting (GGAGTACTGCGTGCAGACTGGGG e GCTTTGCCACCAGGTGGTGTCGG) Lamc1 esone 1 sono stati utilizzati per la costruzione di un vettore sgRNA doppio. Frammenti contenenti due sequenze sgRNA amplificati da PUC-U6-sgRNA-Kana (dal laboratorio Huang Xingxu) utilizzando primer (Lamc1sg1-F: atgcgtctcacaccggagtactgcgtgcagactggttttagagctagaaatagcaag e Lamc1sg2-R: atgcgtcgaaacaccacctggtggcaaagcggtgtttcgtcctttccacaag). Il prodotto di PCR è stato digerito con BsmbI e legato con PX330-GFP linearizzato. I vettori sono stati trasfettati in ESCs e XENCs usando Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific), rispettivamente. Poi le cellule GFP-positive sono state selezionate usando la citometria a flusso e diluite per la crescita monoclonale. Il DNA è stato estratto dalle cellule monoclonali ottenute e sottoposto ad amplificazione PCR e sequenziamento. Le cellule knockout-positive sono state selezionate per gli esperimenti di follow-up.

Per la generazione di linee cellulari knockout Nodal, la sequenza gRNA di targeting (GCCCTCGTCACCGTCCCCTCTGG) esone1 di Nodal sono stati utilizzati per la costruzione del vettore sgRNA. I primer per Nodal sgRNA (Nodal-sgF: caccgctcgtcaccgtcccctc e Nodal-sgR: aaacgaggggacggtgacgagggc) sono stati analizzati e il prodotto analizzato è stato legato a PX330-GFP linearizzato da BbsI. I vettori sono stati trasfettati in ESCs usando Lipofectamine 3000 e le cellule GFP-positive sono state selezionate usando la citometria a flusso e diluite per la crescita monoclonale. Il DNA è stato estratto dalle cellule monoclonali ottenute e sottoposto ad amplificazione PCR e sequenziamento. Le cellule knockout-positive sono state selezionate per gli esperimenti di follow-up.

Per la generazione di p53 knockout linea ESC, la sequenza sgRNA per p53 mutazione è stato clonato nel vettore PX330-GFP (addgene, # 48138) utilizzando CRISPR-Cas9 sistema59. Il vettore è stato trasfettato in G4 ESCs da Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Tre giorni dopo la trasfezione, GFP-positive cellule sono state ordinate e placcato su 6 pozzetti. Le colonie sono stati raccolti, e le regioni knockout sono stati amplificati mediante PCR utilizzando primer (F: CATCCAGGCGGGAAATAGAGAC; R: CCTGACTGTGTGTAAACTAGGC) e sequenziato. Allineando con la sequenza wild-type, le colonie di cellule omozigote knockout sono state identificate e selezionate per ulteriori studi.

Le CSE sono state coltivate in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) con il 15% (v/v) di FBS (Gibco, qualificato per le cellule ES), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoetanolo (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM aminoacidi non essenziali (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM sodio piruvato (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicillina-streptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1000 UI LIF (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM PD0325901 (4423, Tocris), e 3 µM CHIR99021 (4192, Tocris). Le CSE sono state coltivate a 37 °C e al 5% di CO2 su piastre a pozzetti per la coltura di tessuti di grado gelatinizzato e ricoperte da alimentatore, e sono state fatte passare quando è stato raggiunto l’80% di confluenza.

Le CSE sono state derivate da blastocisti E3.5 prelevate dall’utero di topi CD1 femmina di 5 settimane fa15,60 . Le blastocisti sono state coltivate su cellule MEF di topo inattivate mitoticamente (cellule feeder) con terreno di coltura TSC: RPMI 1640 avanzato (11875-093, Thermo Fisher Scientific) integrato con 20% (v/v) FBS (Gibco, qualificato per cellule ES), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoetanolo (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM sodio piruvato (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% (v/v) penicillina-streptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng per mL FGF4 umano ricombinante (235-F4-025, R&D) e 1 µg per mL eparina (07980, Stem Cell). Fino a quando le escrescenze si sono formate il giorno 4, sono state successivamente disaggregate incubandole in 0.1% trypsin-EDTA per 5 min nell’incubatrice. Aggiungere fresco mouse 70% embrionale fibroblasti-condizionato medio contenente FGF4 ed eparina per fermare la reazione e tornare all’incubatore. Sostituire il mezzo ogni due giorni fino a quando le colonie di cellule TS possono essere osservati, e cambiare mezzo con mezzo di coltura TSC per mantenere le cellule. TSC esprimendo EGFP (TSC-EGFP) linee cellulari sono stati derivati da wild-type TSCs che sono stati trasfettati con il vettore PB-UBC-EGFP da JetPrime (114-15, trasfezione Polyplus). Le TSC sono state coltivate a 37°C e al 5% di CO2 su piastre a pozzetti per la coltura di tessuti di grado gelatinizzato e ricoperte di feeder e sono state fatte passare quando è stato raggiunto l’80% di confluenza. Mezzo di coltura è stato cambiato ogni giorno.

XENCs sono stati derivati da blastocisti E3.5 sciacquati dall’utero di 5 settimane-vecchia femmina 129 mouse utilizzando condizioni XENC modificato61. Blastocisti di topo sono stati coltivati su cellule feeder fino a formare una escrescenza il giorno 4 che è stato successivamente disaggregato da incubato in 0,1% tripsina-EDTA per 5 minuti in incubatrice. Aggiungere fresco mouse ES medio delle cellule senza PD0325901 e CHIR99021 per fermare la reazione, e sostituire il mezzo ogni altro giorno fino a colonie di cellule XEN può essere osservato. XEN colonie di cellule è stato mantenuto con mezzo standard XEN: avanzato RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) integrato con il 15% (v/v) FBS (Gibco) e 0,1 mM β-mercaptoetanolo (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1% penicillina-streptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific). La linea cellulare XENC-EGFP è stata derivata direttamente dalla blastocisti di topo Actin-EGFP. Per la cultura senza feeder, le XENC sono state mantenute su una piastra a pozzetti per la cultura dei tessuti rivestita di gelatina. Le cellule XEN sono state coltivate a 37 °C e 5% CO2. Passato una volta che hanno raggiunto il 90% di confluenza. Il mezzo di coltura è stato cambiato ogni giorno.

Generazione di embrioni auto-assemblati

Le CSE, che hanno raggiunto l’80% di confluenza, sono state lavate una volta con PBS (14190-094, Gibco) e sono state incubate per 5 minuti a 37 °C in TrypLE (12605010, Thermo Fisher Scientific). Le TSC e le XENC sono state dissociate in singole cellule mediante incubazione con 0,1% tripsina-EDTA (25300054, Thermo Fisher Scientific) a 37 °C. Le cellule sono state pellettate mediante centrifugazione a 1000 rpm per 5 minuti. Il pellet è stato risospeso in un mezzo embrionale ricostruito pipettando a singole cellule. Le cellule sono state contate automaticamente con un contatore di cellule automatizzato.

Per gli embrioni ETX, mescolare ESC, TSC, e XNECs al numero di cellule di 1 × 105, 1 × 105, e 2 × 105, rispettivamente (per gli embrioni ETS, mescolare ESCs e TSCs al numero di cellule di 1 × 105 e 1 × 105, rispettivamente; per EXE-embrioni, mescolare ESCs, e XENCs al numero di cellule di 1 × 105 e 1 × 105, rispettivamente) con 2 mL di terreno embrionale ricostruito per 35 mm non trattato piatto di coltura cellulare. Spostare il piatto sui rotatori orizzontali a 37 °C, 5% CO2 e 100% di umidità. Il tasso di rotazione è a 60 giri al minuto. Il mezzo embrione ricostruito comprende 39% avanzato RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) e 39% DMEM (11960069, Thermo Fisher Scientific) supplemento con 17,5% FBS (Gibco, cellule ES qualificato), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoetanolo (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM MEM aminoacidi non essenziali (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM sodio piruvato (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicillina-streptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific). Cambiato mezzo con 2 mL di terreno embrionale fresco ricostruito ogni giorno.

EXE-embrioni formati in modo coerente ed efficiente, gli esperimenti funzionali possono essere eseguiti senza selezione di strutture regolari o irregolari. Per gli esperimenti funzionali di ETX-embrioni e ETS-embrioni, abbiamo selezionato le strutture regolari in base alla loro morfologia, e le proporzioni e le posizioni appropriate dei compartimenti ESC e TSC mediante indicazione di TSC-EGFP al microscopio a fluorescenza stereo.

Recupero degli embrioni di tipo Wild e coltura in vitro

Le blastocisti sono state recuperate da topi femmine gravide superovulate E4.5 mediante lavaggio uterino con M2 (MR-015-D, Millipore). Coltura di embrioni in mezzo IVC dopo la rimozione del trophectoderm murale in vitro su 8 pozzetti μ-Slides (80826, Ibidi)62. Per il recupero di E5.5, E5.75, e E6.5 embrioni, dissezione della decidua dall’utero descrivere come il protocollo riportato 63. Per EPI-espianti da topi CD1 sono stati sezionati il giorno E5.0 come precedentemente riportato28 e coltivato con ETX-embrioni media in vitro.

Immunofluorescenza colorazione

Gli embrioni di topo e gli embrioni ricostruiti sono stati fissati con paraformaldeide 4% (DingGuo, AR-0211) a 4 ° C per 20 min e lavato tre volte con un tampone di lavaggio (PBS contenente 0,1% Tween-20). Poi, gli embrioni sono stati permeabilizzati con 0,5% Triton X-100 (H5142, Promega) per 30 min a temperatura ambiente e sono stati incubati con anticorpi primari in tampone di blocco (3% BSA, 0,3% Triton X-100) per una notte a 4 ° C. Dopo essere state lavate per rimuovere gli anticorpi primari non legati, le cellule sono state incubate con l’anticorpo secondario in tampone di bloccaggio per una notte a 4 °C. Nucleo delle cellule sono stati colorati con DAPI, seguita da due lavaggi con tampone di lavaggio, poi sono stati montati in Fluoroshield Mounting Medium con DAPI (104140, abcam). Le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale Nikon A1.

Immagini con elaborazione e analisi

Le immagini degli embrioni di topo e degli embrioni ricostruiti sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale Nikon A1 con un obiettivo 20 × o 40 ×. Tutte le analisi sono state effettuate utilizzando il software di analisi delle immagini open-source “Fiji”. Il volume dei tessuti e il numero di cellule per gli embrioni ricostruiti e gli embrioni wild-type sono stati stimati e le misure di intensità di immunofluorescenza per l’analisi di distribuzione PCX è stata eseguita anche utilizzando il software Fiji9.

High-throughput singola cella qPCR e l’elaborazione dei dati

Per l’isolamento singola cella, alcune cellule in diverse fasi di sviluppo (0, 24 e 84 h) sono stati raccolti da due tipi di ETX-embrioni, che sono stati ricostruiti con Lefty1-mCherry XENC (LC-ETX-embrioni) e BVSC ESC (BVSC-ETX-embrioni) linee cellulari reporter, rispettivamente. Per isolare le singole cellule, selezioniamo solo il LC-ETX-embrioni con DVE / AVE-come tessuti identificati da espressione asimmetrica delle proteine mCherry, e selezionare il BVSC-ETX-embrioni con espressione asimmetrica delle proteine mVenus nel vano ESC vicino al confine tra il compartimento ESC- e TSC. Per LC-ETX-embrioni, 0, 24, e 84 h LC negativo cellule derivate ESC (LC- XEN) così come 84 h positivo ESC (BVSC + ES) dal lato opposto di LC- XEN sono stati raccolti. Per gli embrioni BVSC-ETX, sono state raccolte 0, 24 e 84 h di cellule derivate da ESC negative (BVSC- ES) e 84 h di ESC positive (BVSC+ ES) dal lato opposto di BVSC- ES. Inoltre, singole cellule da compartimenti TSC in ETX-embrioni assemblati con BVSC-ESCs a 0, 24, e 84 h sono stati raccolti sulla base di EGFP reporter.

Per la separazione delle singole cellule, tutti ETX-embrioni sono stati incubati in 0,1% tripsina-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, USA) per 5 min a 37 ° C e poi trasferito in mezzo M2 (MR-015-D, Millipore). Dopo un delicato pipettaggio ripetuto con la bocca per diverse volte, le singole cellule sono state isolate con una punta di vetro finemente tirata. In media, 30-40 cellule sono state raccolte per ogni tipo. Ogni cella è stata lavata tre volte in Dulbecco fosfato-buffered salina (Invitrogen, Carlsbad, USA) contenente 0,1% BSA (Sigma-Aldrich, MO, USA), e messo in trascrizione inversa-polimerasi reazione a catena (RT-PCR) master mix per la lisi, sequenza-specifica trascrizione inversa, e pre-amplificazione, come descritto come relazione precedente64.

Per la progettazione e la convalida dei primer, i geni che regolano la differenziazione del lignaggio cellulare (principalmente da E3.5 a E6.5 stadio) e partecipano alla via di segnalazione dominante (ad esempio, Wnt, via di segnalazione Nodal) sono stati selezionati, secondo l’embriogenesi del topo. Le sequenze di mRNA per ogni gene interessato sono state recuperate da NCBI e solo le regioni comuni sono state utilizzate per i geni con trascrizioni diverse. Gene-specifici primer qRT sono stati progettati con il software Primer3 entro la lunghezza di 100-250 bp. Tutti i primer erano stati testati utilizzando cDNA di embrioni di topo (miscela di E5.5 e E6.5) per l’efficienza di amplificazione e specificità (elencati nei dati supplementari 1).

Singola cella sequenza-specifica pre-amplificazione simile alla relazione precedente65. Un totale di 96 set di primer sono stati raggruppati ad una concentrazione finale di 0,1 μM per ogni primer. Le singole cellule isolate dagli embrioni sono state trasferite in microprovette sterili caricate con 5 μL di miscela master RT-PCR contenente 2,5 μL di miscela di reazione CellsDirect (Invitrogen, Carlsbad, USA), 0,5 μL di pool di primer, 0,1 μL di enzima RT/Taq (Invitrogen, Carlsbad, USA), e 1,9 μL di acqua senza nucleasi (Invitrogen, Carlsbad, USA) in ogni tubo. Le provette sono state immediatamente congelate su ghiaccio secco. Dopo una breve centrifugazione a 4 °C, le provette sono state immediatamente messe nella macchina PCR. Le lisie delle cellule e le trascrizioni inverse specifiche della sequenza sono state eseguite a 50 °C per 1 h. Successivamente, l’inattivazione della trascrittasi inversa e l’attivazione della Taq polimerasi sono state ottenute riscaldando a 95 °C per 3 minuti. Successivamente, nella stessa provetta, il cDNA è stato sottoposto a 20 cicli di amplificazione sequenza-specifica mediante denaturazione a 95 °C per 15 s, e annealing ed elongazione a 60 °C per 15 min. Per evitare l’evaporazione, i prodotti risultanti sono stati conservati a -80 °C.

Per la PCR quantitativa ad alta produttività microfluidica monocellulare, tutti i prodotti cDNA preamplificati sono stati convalidati dal sistema di PCR in tempo reale (ABI 7500) utilizzando il gene di controllo endogeno Actinb, solo soglia di attraversamento (Ct) valore entro 9 a 12 sono stati selezionati per il successivo esperimento. I campioni di cellule singole amplificati sono stati analizzati con SsoFast EvaGreen Supermix con Low ROX (Bio-Rad, California, USA) e primer qPCR individuali in array dinamici 96 × 96 su un sistema Biomark (Fluidigm, San Francisco, USA). Calcolo dei valori Ct sono stati condotti con il software BioMark Real-Time PCR Analysis (Fluidigm, San Francisco, USA).

Per l’elaborazione e la visualizzazione dei dati delle singole cellule, tutti i valori Ct grezzi ottenuti dal sistema BioMark sono stati convertiti in livelli di espressione relativa Log2 sottraendo i valori dal valore Ct di fondo presunto di 26. I campioni con espressione bassa o assente dei geni di controllo endogeni (Actinb e Gapdh) sono stati esclusi dalle analisi successive. PLS-DA è stato applicato ai dati di espressione per discriminare i gruppi di cellule in diversi ETX-embrioni con R pacchetto mixOmics66. Clustering gerarchico è stato eseguito utilizzando le distanze euclidee, e dendrogrammi sono stati visualizzati lungo le heatmaps righe scalate utilizzando il pacchetto fluidigmSC. Box-plot e trame violino sono stati generati con l’origine 8.6 e R software.

BVSC ESC-Chimeric produzione di embrioni

Abbiamo prodotto gli embrioni BVSC ESC-Chimeric da 8 cellule metodo di iniezione embrionale da Piezo Micromanipulation67. Per garantire che gli embrioni ospite sono stati iniettati prima della compattazione, abbiamo raccolto gli embrioni a due cellule stadio e coltivato in vitro. Per ottenere due cellule embrioni stadio, 5 settimane-vecchio topi femmina sono stati superovulati da iniezione intraperitoneale di cinque unità internazionali (UI) di PMSG, seguita da 5 UI HCG 46-48 ore dopo, e accoppiato con topi maschi. Gli embrioni a due cellule sono stati raccolti lavando l’ovidotto con M2 a E1.5. Gli embrioni sono stati lavati in M2 (MR-015-D, Millipore) e poi trasferiti in 10 μL KSOM (MR-020P-5F, Millipore) gocce coperte di olio minerale su un piatto di coltura dei tessuti. Gli embrioni sono stati mantenuti a 37 ° C con il 5% di CO2 in un incubatore.

Circa 15 cellule ES sono stati iniettati in embrioni stadio 8 cellule da Piezo Micromanipulation67,68. Femmine CD1 di otto settimane accoppiate con maschi vasectomizzati sono state usate come topi pseudogravidi. Iniettato blastocisti sono stati trasferiti nell’utero di femmine pseudopregnanti a 2,5 giorni post coito (dpc). Gli embrioni allo stadio di morula con le CSE iniettate sono stati trasferiti nell’ovidotto di destinatari a 0,5 dpc. Abbiamo trasferito 14-16 embrioni per ricevente. A E6.5, abbiamo raccolto gli embrioni chimerici dalle deciduae come descritto sopra.

Trasferimento degli embrioni e valutazione dell’impianto

Le femmine CD1 di otto settimane accoppiate con maschi vasectomizzati sono state usate come topi pseudopregnanti. Per gli embrioni ricostruiti, 36 h sfere ricostruite (ETX-, ETS-, e EXE-embrioni) sono stati trasferiti nelle corna dell’utero di topi femmina CD1 pseudopregnanti destinatari a 2.5 dpc o 3.5 dpc. Da sedici a venti embrioni sono stati trasferiti per destinatario. Siti di impianto il giorno 6.5 sono stati identificati e contati per iniezione endovenosa di 100 μL 1% soluzione Chicago Sky Blue. La lunghezza e il raggio di ogni decidua è stato misurato utilizzando un software di analisi delle immagini, e il volume è stato calcolato da queste misure come V = πr2l.

HE colorazione e immunostaining dei siti di impianto

Per esaminare il potenziale di sviluppo degli embrioni auto-assemblati, abbiamo raccolto decidua da diversi stadi, tra cui 48, 72, e 84 h dopo il trapianto. Questi campioni di embrioni ricostruiti (ETX, EXE e ETS) sono stati fissati con paraformaldeide al 4% per una notte a 4 °C, disidratati con alcoli a gradiente, trasferiti in xilene e incorporati in paraffina. Abbiamo usato E5.5, E6.0, e E6.5 embrioni wild-type come controllo. I campioni sono stati affettati a 5 micron di spessore, colorati con ematossilina ed eosina, e osservati al microscopio. Deparaffinati campioni reidratati sono stati sottoposti a calore indotta epitope retrieval in tampone citrato a circa 95 ° C da un forno a microonde per 10 min, in seguito raffreddato a temperatura ambiente e risciacquato due volte in PBS con 3 min per due volte. La permeabilizzazione è stata eseguita con 0,5% Triton X-100 in PBS per 20 min a temperatura ambiente. Dopo la permeabilizzazione, i campioni sono stati lavati in PBS per tre volte (3 min ciascuno). Poi i campioni sono stati bloccati per 30 min con il 5% di sieroalbumina bovina (BSA) in PBS e incubati con anticorpi primari contro il coniglio anti-CK (ab9377, Abcam), coniglio anti-COX2 (ab15191, Abcam), coniglio anti-Laminina (L9393, Sigma), capra anti-Gata4 (sc-1237, Santa Cruz), o Mouse anti-PL1 (sc-376436, Santa Cruz) a 4 ° C durante la notte. Il giorno seguente, le fette sono state lavate tre volte in PBS per 5 min e incubate con l’anticorpo secondario per 30 min a 37 °C. Anticorpi secondari sono stati etichettati con Alexa Fluorophore 488 o 594 (Invitrogen). Successivamente, le sezioni sono state sciacquate sei volte in PBS con 5 min ciascuno e montato con Fluoroshield mezzo di montaggio con DAPI (ab104140, Abcam). I vetrini sono stati tenuti a -20 °C fino all’osservazione. Le immagini sono state catturate con un microscopio fluorescente Leica.

Ibridizzazione in situ

Ibridizzazione in situ con digossigenina (DIG) è stata eseguita su criosezioni52. Sonde cRNA specifiche per topo per Dtprp sono stati utilizzati per l’ibridazione. Sezioni ibridate con sonde senso servito come controlli negativi. Sezioni congelate (8-10 μm) sono stati aderiti a poli-l-lisina rivestiti vetrini (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, Cina) e conservati a -80 ° C fino all’uso. Sezioni sono stati posti su un vetrino riscaldatore (37 ° C) per 2 min e poi reidratati in PBS, post-fissati in 4% PFA per 15 min a 4 ° C, trattati con proteinasi K (15 mg per mL per 5 min a temperatura ambiente), 0,25% acetilato per 10 min e ibridato con DIG-marcato sonde durante la notte a 65 ° C. Due 65 ° C post-ibridazione lavaggi sono stati effettuati seguiti da due lavaggi in 1 × MABT, e 30 min trattamento RNase (20 mg per mL) a 37 ° C. Sezioni sono stati bloccati per 1 h, e incubato durante la notte in blocco con anticorpo anti-DIG (1:2500, Sigma-Aldrich). Dopo il lavaggio, il colore è stato sviluppato utilizzando NBT/BCIP fino a quando un precipitato marrone era visibile. I vetrini sono stati controcolorati con rosso veloce nucleare, disidratati e puliti in xilene, e montati in mezzo di montaggio citosale. Le fotografie sono state scattate prontamente prima della dissolvenza del precipitato INT/BCIP si è verificato.

Identificazione genotipica degli embrioni trasferiti auto-assemblati

Il DNA genomico è stato estratto da DsRed-ESCs, EGFP-TSCs, e ETX-embrioni isolati da tessuti decidua utilizzando un TIANamp Micro DNA Kit (DP316, Tiangen) secondo le istruzioni del produttore. Il set di primer diagnostici EGFP (5ʹ-AGGACGTCATCAAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATAGTCTTCTTG-3ʹ) e DsRed (5ʹ-GTGCTTCAGCCGCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCACCTTGATGCCGTTCT-3ʹ) sono stati usati per identificare la regione delle cellule e dei campioni tramite PCR. Il profilo termico era 95 °C per 5 min, 35 cicli di 95 °C per 30 s, 60 °C per 30 s, e 72 °C per 20 o 40 s, e un ciclo finale a 72 °C per 5 min.

Statistiche

Le analisi statistiche sono state elaborate con il software GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA) per Windows (compresi i dati di espressione Log2 su singola cellula). I dati sono stati controllati per la distribuzione normale e varianze uguali con F-test prima di ogni test statistico parametrico è stato eseguito. Se del caso, test t di Student a due code sono stati eseguiti con la correzione di Welch se la varianza tra i gruppi non era uguale. Le barre di errore rappresentano l’errore standard di s.e.m o s.d. come specificato. Figura legende indicano il numero di esperimenti indipendenti eseguiti in ogni analisi. Ogni esperimento era stato ripetuto per riproducibilità.

Il volume del tessuto (Figg. 1i e 7c, e Fig. supplementare 4h), percentuale e calcolo del numero (Figg. 2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m, e 7n; Figg. supplementari 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a e 12g) è stato determinato utilizzando Excel. L’analisi di significatività è stata eseguita utilizzando il t-test di GraphPad Prism. Grafici a barre sono stati disegnati da Excel e GraphPad Prism, e scatterplot sono stati tracciati utilizzando GraphPad Prism.

Reporting summary

Più informazioni sul disegno sperimentale è disponibile nel Nature Research Reporting Summary collegato a questo articolo.