Komunitní zdroj
Komunitní zdroj poskytuje kompletní soubor imunologických dat 460 volně žijících myší (Supplementary Data 1). Z něj podrobně porovnáváme podskupinu 181 divokých myší (100 samců, 81 samic) z jedné lokality (lokalita HW, obr. 1a, doplňková tabulka 1) s 64 laboratorně chovanými, patogenů prostými myšmi C57BL/6 (24 samců, 40 samic). Výsledky tohoto srovnání jsou uvedeny v tabulkách 1,2 a v doplňkové tabulce 2, přičemž druhá z nich je příliš rozsáhlá na to, aby se vešla do hlavního textu článku.
Divoké myši se imunologicky liší od laboratorních myší
Serologické a morfometrické parametry divokých (HW) a laboratorních (C57/BL6) myší jsou shrnuty v tab. 1. Divoké myši byly mnohem menší než laboratorní (vážily jen o polovinu méně) a mezi divokými myšmi byly věk, délka těla a hmotnost vysoce korelované (délka a hmotnost, Pearsonovy korelace (two-tailed) r=0,79; věk a hmotnost, r≥0,77; věk a délka, r=0,58, P<0,001, n>80 pro samce a samice myší zvlášť) (Doplňková data 2). Divoké myši měly medián věku 6,6 týdne (rozmezí 1-39,5) a mnoho imunitních parametrů korelovalo s věkem a velikostí, pravděpodobně v důsledku kumulativního vystavení infekci (Doplňková data 2). Z 62 imunologických ukazatelů se většina (57 ukazatelů) lišila mezi divokými a laboratorními myšmi (tabulka 1, tabulka 2, doplňková tabulka 2). Mezi divokými myšmi bylo velmi málo (6 z 62 měr) významných imunologických rozdílů mezi samci a samicemi, zatímco laboratorní myši byly více (18 z 62 měr) imunologicky pohlavně dimorfní (tabulka 1, tabulka 2, doplňková tabulka 2).
Multilokusové genotypování ukazuje, že HW divoké myši jsou nestrukturovanou, geneticky rozmanitou populací (obr. 1b, doplňková data 3). Divoké myši se geneticky liší od deseti kmenů laboratorních myší a laboratorní kmeny jsou geneticky rozmanitější než divoké myši. Domníváme se, že tento genetický vztah mezi divokými a laboratorními myšmi lze vysvětlit mozaikovitostí genomů laboratorních myší4 , skutečností, že laboratorní myši byly po mnoho generací od sebe záměrně oddělovány, a tím, že laboratorní kmeny jsou z velké části homozygotní.
Divoké myši nesou značnou zátěž infekcí
Vyšetřili jsme divoké myši na důkazy infekce viry a Mycoplasma pulmonis a na důkazy infekce ektoparazity a střevními hlísticemi; dodavatelé potvrdili, že laboratorní myši jsou bez infekce. Séroprevalence různých mikrobiálních infekcí se pohybovala v rozmezí od 22 % u minutového viru do 92 % u parvoviru (n=153 pro obě analýzy; doplňková tabulka 3). Volně žijící myši byly běžně infikovány oxyuridní hlísticí Syphacia spp. (prevalence 91 %) a roztočem Myocoptes musculinus (prevalence 82 %) (n=181 v obou případech). Infekce divokých myší byla velmi častá: všechny divoké myši byly infikovány alespoň jedním patogenem a pouze 5 % (8 ze 153) bylo séronegativních na všechny viry a M. pulmonis. Pohlaví nemělo žádný vliv na intenzitu nebo prevalenci infekce (doplňková tabulka 3).
Divoké myši mají velmi vysoké koncentrace sérových proteinů
U divokých myší byly sérové koncentrace IgG a IgE 20-, resp. 200krát vyšší než u laboratorních myší (obr. 2). Mezi divokými myšmi byly koncentrace IgE výrazně vyšší u samic než u samců (tab. 1). Naproti tomu koncentrace IgA ve stolici se mezi divokými a laboratorními myšmi významně nelišily (obr. 2, tab. 1). Divoké myši měly také významně vyšší sérové koncentrace proteinů akutní fáze, sérové složky amyloidu P (SAP) a haptoglobinu než laboratorní myši (obr. 2, tab. 1). Tyto rozdíly nebyly způsobeny vyššími celkovými koncentracemi sérových bílkovin u divokých myší, protože koncentrace alfa-1 antitrypsinu (AAT) – stabilní složky normálního séra – se mezi divokými a laboratorními myšmi nelišily (obr. 2, tab. 1).
Koncentrace sérových proteinů imunoglobulinů G, E a A a SAP, haptoglobinu a AAT u divokých (stínovaných) a laboratorních (nestínovaných) myší jsou uvedeny ve stupnici log10. Středy boxů jsou mediány a hranice boxů 25. a 75. percentil, whiskery 1,5násobek mezikvartilového rozpětí a odlehlé hodnoty jsou znázorněny tečkami. Hvězdičky označují významné rozdíly jako ***P<0,001 (Mannův-Whitneyho U test; tabulka 1) a § označuje, že existují další účinky pohlaví podrobně popsané v tabulce 1. Velikosti vzorků jsou uvedeny v tabulce 1 a doplňkových údajích 1.
Divoké myši byly heterogennější v koncentracích imunoglobulinů a proteinů akutní fáze ve srovnání s laboratorními myšmi (obr. 2, tabulka 1, doplňková tabulka 4). Ačkoli jsou výchozí koncentrace SAP částečně geneticky podmíněné13 , významná korelace mezi koncentracemi SAP a haptoglobinu (Pearsonovy korelace (two-tailed) r=0,41, P<0,0001, r=0,33, P=0,004 pro 96 samců a 77 samic; doplňková data 2) naznačuje, že pravděpodobnými příčinami této heterogenity jsou zánět a/nebo infekce. U divokých myší byly sérové koncentrace IgG a IgE významně, pozitivně korelovány s věkem (Pearsonova korelace (two-tailed) r>0,2, P<0,05, n≥79; Doplňková data 2), což pravděpodobně odráží kumulativní expozici infekci. To lze explicitně pozorovat u koncentrací IgE, které byly významně pozitivně korelovány s počtem mikrobiálních infekcí u samců divokých myší (Pearsonova korelace (two-tailed) r=0,23, P=0,036, n=80; doplňková data 2). U samic divokých myší byla koncentrace IgA ve stolici vysoce korelována s počtem mikrobiálních infekcí a s počtem roztočů (mikrobiální infekce Pearsonova korelace (two-tailed) r=0,58, P<0,0001, n=35; počet roztočů r=-0,380, P=0,01, n=45; Doplňková data 2).
Splenocyty divokých myší se liší od splenocytů laboratorních myší
Splenocyty divokých myší byly mnohem menší (přibližně třetinová hmotnost) než u laboratorních myší a obsahovaly výrazně méně (přibližně pětinový počet) životaschopných mononukleárních leukocytů (tabulka 1). Ještě překvapivější je, že sleziny divokých myší byly výrazně proporcionálně menší (tj. ve srovnání s tělesnou hmotností) než sleziny laboratorních myší (tab. 1).
Ex vivo průtoková cytometrická kvantifikace a charakterizace buněčných populací sleziny (obr. 3, 4, 5, 6, doplňkový obr. 1). 1) ukázala, že divoké myši měly nižší absolutní počty T-buněk, B-buněk, NK-buněk, dendritických buněk, makrofágů a neutrofilů než laboratorní myši, což odpovídá jejich nižšímu absolutnímu počtu mononukleárních buněk sleziny (Doplňková data 1). Poměrně však měly sleziny divokých myší výrazně více T-buněk, vyšší poměr T:B-buněk a více CD11b+ myeloidních buněk, ale méně NK-buněk a dendritických buněk než laboratorní myši (doplňková tabulka 2); poměr CD4+: CD8+ T-lymfocyty byly také významně vyšší u divokých myší než u laboratorních myší. Tyto rozdíly odpovídají hromadění pomocných T-buněk a fagocytujících buněk ve slezině divokých myší v reakci na systémové infekce.
Strategie gatingu průtokové cytometrie a podíly podskupin CD3+ T buněk u divokých (stínovaných) a laboratorních (nestínovaných) myší pro (a) CD4+ buňky, (b) CD4+ Treg buňky, (c) CD8+ buňky a jejich stav zrání a (d) terminálně diferencované CD8+ buňky. CD4+ a CD8+ efektorové/efektorové paměťové buňky jsou definovány jako CD62L- CD44hi a centrální paměťové buňky jsou CD62L+ CD44hi. Středy boxů jsou mediány a hranice boxů 25. a 75. percentil, whiskery 1,5násobek mezikvartilového rozpětí a odlehlé hodnoty jsou znázorněny tečkami. Hvězdičky označují významné rozdíly jako *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (Mannův-Whitneyho U test; doplňková tabulka 2) a § označuje, že existují další účinky pohlaví podrobně popsané v doplňkové tabulce 2. Strategie brány pro CD3+ lymfocyty je znázorněna na doplňkovém obrázku 1. Velikosti vzorků jsou uvedeny v Doplňkové tabulce 2 a Doplňkových údajích 1.
(a) Strategie gatingu průtokové cytometrie k charakterizaci CD19+ B buněk jako naivních (N), paměťových (M) nebo buněk zárodečného centra (G) B u divokých a laboratorních myší a (b) podíly těchto tří subpopulací, (c) jejich exprese MHC II. třídy a (d) vazba PNA, přičemž posledně jmenované jsou zobrazeny ve stupnici log10. Myši jsou divoké (stínované) a laboratorní (nestínované). Středy boxů jsou mediány a hranice boxů 25. a 75. percentil, whiskery 1,5násobek mezikvartilového rozpětí a odlehlé hodnoty jsou znázorněny tečkami. Hvězdičky označují významné rozdíly jako **P<0,01, ***P<0,001 (Mannův-Whitneyho U test; doplňková tabulka 2) a § označuje, že existují další účinky pohlaví podrobně popsané v doplňkové tabulce 2. Velikosti vzorků jsou uvedeny v Doplňkové tabulce 2 a v Doplňkových údajích 1. Strategie brány pro CD19+ lymfocyty je uvedena na doplňkovém obrázku 1.
(a) strategie gatingu průtokové cytometrie k identifikaci CD11b+ CD11c- myeloidních buněk a podíl myeloidních buněk mezi slezinnými leukocyty u divokých (stínovaných) a laboratorních (nestínovaných) myší, (b) gating myeloidních buněk na základě exprese F4/80 a Ly6G k definici M1 (makrofágů rezidenčních ve tkáni), M2 (monocyty), M3 (hypergranulocytární myeloidní buňky, HGMC) a M4 (polymorfonukleární leukocyty, PMN), c) exprese Ly6G potvrzující přítomnost tří buněčných populací u laboratorních myší a čtyř populací u divokých myší, d) charakteristiky bočního rozptylu populací M1-M4 u divokých (stínovaných, n≥115) a laboratorních (nestínovaných n≥57) myší; Všimněte si, že v bráně M3 u laboratorních myší bylo přítomno příliš málo buněk na to, aby bylo možné přesně určit statistiku bočního rozptylu, e) charakteristiky rozptylu buněk M3 (vlevo) a M4 (vpravo), které odhalují nízký přímý rozptyl neutrofilní populace (M5) a vysoký přímý rozptyl populace supresorových buněk odvozených od myeloidů (M6) mezi buňkami M4, (f) poměry subpopulací M1, M2, M3 a M4 mezi populací myeloidních buněk u divokých (stínovaných) a laboratorních (nestínovaných) myší a (g) gating CD11c+ dendritických buněk a jejich poměry mezi splenocyty u divokých a laboratorních myší. U krabicových grafů jsou středy krabic mediány a hranice krabic 25. a 75. percentil, whiskery 1,5násobek mezikvartilového rozpětí a odlehlé hodnoty jsou znázorněny tečkami. Hvězdičky označují významné rozdíly jako *P<0,05, ***P<0,001 (Mannův-Whitneyho U test; doplňková tabulka 2) a § označuje, že existují další vlivy pohlaví podrobně popsané v doplňkové tabulce 2. Velikosti vzorků jsou uvedeny v Doplňkové tabulce 2 a Doplňkových údajích 1.
(a) Strategie gatingu průtokové cytometrie s využitím exprese CD27 a CD11b pro klasifikaci NKp46+ CD3- slezinných NK buněk divokých a laboratorních myší do stadií 1-4 zralosti, (b) podíly NK buněk v každém takovém stadiu u divokých (stínované) a laboratorních (nestínované) myší a exprese (c) CD69 a (d) KLRG1 u každé podskupiny (tabulka 2). Jsou také zobrazeny (e-h) strategie gatingu pro receptory Ly49 a podíly NK buněk exprimujících, (e) různé kombinace Ly49D a Ly49G2, (f) Ly49D, (g) Ly49G2 (Ly49G2+ buňky gatingované na Ly49G2-, Ly49G2low a Ly49G2high buňky) a (h) Ly49H. Divoké myši jsou zobrazeny jako stínované krabicové grafy, laboratorní myši jako nestínované. Středy boxů jsou mediány a hranice boxů 25. a 75. percentil, whiskery 1,5násobek mezikvartilového rozpětí a odlehlé hodnoty jsou znázorněny tečkami a některé osy jsou ve stupnici log10. Hvězdičky označují významné rozdíly jako **P<0,01, ***P<0,001 (Mannův-Whitneyho U test; tabulka 2) a § označuje, že existují další účinky pohlaví podrobně popsané v tabulce 2. Strategie brány pro NKp46+ CD3- lymfocyty je znázorněna na doplňkovém obr. 1. Velikosti vzorků jsou uvedeny v tabulce 2 a v doplňkových údajích 1.
Stav CD4+ a CD8+ T buněk se výrazně lišil mezi divokými a laboratorními myšmi. U CD4+ T buněk byl výrazně větší podíl efektorových/efektorových paměťových (CD62L- CD44hi) a centrálních paměťových (CD62L+ CD44hi) buněk (a tedy proporcionálně méně naivních, CD62L+ CD44low), u divokých myší ve srovnání s laboratorními (doplňková tabulka 2, obr. 3a). Ačkoli podíl CD4+ T buněk, které byly Foxp3+ CD25+ Treg buňkami, byl u divokých myší nepatrně vyšší než u laboratorních (doplňková tabulka 2, obr. 3b), nestačilo to k vyrovnání mnohem většího podílu efektorových CD4+ T buněk, takže poměr efektorových CD4+ T buněk k Treg byl u divokých myší výrazně vyšší než u laboratorních (doplňková tabulka 2).
Podobně u CD8+ T buněk měly divoké myši významně vyšší podíl efektorových/efektorových paměťových (CD62L- CD44hi) a terminálně diferencovaných (KLRG1+) buněk než laboratorní myši (a tedy významně nižší podíl naivních) (obr. 3c,d). Divoké myši měly také proporcionálně méně centrálních paměťových (CD62L+ CD44hi) CD8+ T buněk než laboratorní myši; tento rozdíl byl částečně způsoben nízkou frekvencí těchto buněk u divokých myších samců (doplňková tabulka 2), ale může také odrážet relativní rozložení antigenem zkušených CD8+ T buněk mezi paměťovou a efektorovou podskupinu. Poměr efektorových/efektorových paměťových CD8+ T buněk k Tregs byl opět významně vyšší u divokých než u laboratorních myší (doplňková tabulka 2).
V souladu s myšlenkou, že častá nebo trvalá výzva patogenu vede k expanzi podskupin antigenem zkušených CD4+ a CD8+ T-buněk u divokých myší, byly zjištěny významné pozitivní korelace mezi podílem efektorových CD4+ a CD8+ T-buněk a věkem u samic divokých myší (Pearsonovy korelace (two-tailed) věk a efektorové CD4+ r=0,62, P<0,0001, n=51. U samic divokých myší byly zjištěny významné pozitivní korelace mezi podílem efektorových CD4+ a CD8+ T-buněk a věkem; věk a efektorové CD8+ r=0,49, P<0,0001, n=50; doplňková data 2). Je zajímavé, že tyto parametry nebyly silně korelovány s věkem u samců divokých myší (Pearsonova korelace (two-tailed) r<0,1, P>0,05, n=66), což poukazuje na rozdílné imunologické strategie samců a samic divokých myší.
Na rozdíl od vysoce primed/efektorového stavu slezinných T buněk měly CD19+ B lymfocyty divokých myší převážně naivní fenotyp. Splenické CD19+ B lymfocyty jsme kategorizovali jako naivní (CD38+ IgD+), paměťové (CD38+ IgD- GL7-) nebo buňky zárodečného centra (CD38lo IgD- GL7hi)14 a identifikovali jsme nedávno aktivované, antigenem zkušené buňky podle jejich exprese MHC II. třídy a vazby arašídového aglutininu (PNA; indikuje expresi receptoru PNA, PNA-R)15 (obr. 4a). Navzdory velmi vysokým sérovým koncentracím imunoglobulinů obsahovaly sleziny divokých myší významně vyšší podíl naivních B buněk (a naopak významně nižší podíl paměťových B buněk) než sleziny laboratorních myší (obr. 4b,c). Toto zpočátku neintuitivní pozorování pravděpodobně odráží realokaci antigenem zkušených B buněk ze sleziny do kostní dřeně, do jiných lymfoidních tkání nebo do míst infekce spolu s kontinuální repopulací sleziny naivními B buňkami pocházejícími z kostní dřeně. Divoké myši měly ve slezině proporcionálně více B-buněk zárodečného centra než laboratorní myši a vazba PNA byla u divokých myší relativně vyšší na všech podskupinách B-buněk, což odpovídá nedávné aktivaci15 (obr. 4d, doplňková tabulka 2). Tyto výsledky společně poukazují na vysoký obrat aktivovaných CD19+ B buněk ve slezině divokých myší.
Divoké myši mají dosud neznámou populaci myeloidních buněk
Dále jsme identifikovali myeloidní buňky jako CD11b+ CD11c- (obr. 5a) a analyzovali jejich expresi F4/80 a Ly6G, čímž jsme odhalili čtyři subpopulace F4/80+ buněk, označené M1-M4 (obr. 5b-d). Patří sem F4/80+ Ly6G- (M1) tkáňové rezidentní makrofágy, F4/80+ Ly6Glow (M2) monocyty/červené makrofágy a F4/80+/-Ly6Ghigh (M4) polymorfonukleární buňky (PMN). Populaci M4 PMN bylo možné dále rozdělit na neutrofily a myeloidní supresorové buňky na základě jejich charakteristik přímého a bočního rozptylu (obr. 5e). Důležité je, že u divokých, ale nikoli laboratorních myší jsme identifikovali další populaci F4/80+ buněk exprimujících hladiny Ly6G, které jsou na pomezí mezi monocyty/makrofágy a PMN (M3). Pokud je nám známo, jedná se o novou, dosud nepopsanou populaci buněk, kterou jsme na základě jejich charakteristik přímého a bočního rozptylu označili jako hypergranulocytární myeloidní buňky (HGMC) (obr. 5c-e). Ačkoli existují určité drobné rozdíly v úrovni exprese Ly6G mezi populacemi M2 a M3/M4 u divokých a laboratorních myší (obr. 5c), zpětné gatingy jednotlivých populací na základě CD11b, CD11c a přímého a bočního rozptylu potvrdily, že populace M2 u divokých a laboratorních myší jsou jinak identické a že populace Ly6Ghigh u laboratorních myší je ekvivalentní populaci M4 u divokých myší (obr. 5d). Srovnání bočního rozptylu pro jednotlivé populace také potvrdilo, že hypergranulocytární populace M3 s vysokým bočním rozptylem se skutečně vyskytuje pouze u divokých myší (obr. 5f). Funkční význam těchto buněk je zatím neznámý, ale jejich objevení zdůrazňuje, že studium laboratorních myší nemusí nutně odhalit celý arzenál imunitního systému.
Divoké myši měly ve slezině nejen proporcionálně více CD11b+ CD11c- myeloidních buněk než laboratorní myši, ale v rámci myeloidní populace byly PMN a HGMC obohaceny na úkor makrofágů a monocytů (obr. 5a,f, doplňková tabulka 2). Expanze a/nebo akumulace neutrofilů a HGMC ve slezině divokých myší odpovídá nedávnému nebo současnému vystavení divokých myší infekci. Splenické CD11c+ dendritické buňky byly proporcionálně vzácnější u divokých myší ve srovnání s laboratorními myšmi (obr. 5g, doplňková tabulka 2).
Divoké myší NK buňky jsou vysoce aktivované
Podle exprese CD27 a CD11b jsme charakterizovali NKp46+ CD3ɛ- NK buňky (obr. 6) jako časné (stadium 1), střední (stadium 2), pozdní (stadium 3) nebo plně zralé (stadium 4) (obr. 6a). Divoké myši měly vyšší podíl buněk stadia 1 a stadia 2 a nižší podíl buněk stadia 3 a stadia 4 slezinných NK buněk, což vedlo k významně vyššímu poměru časných/středních NK buněk k pozdním/zralým NK buňkám než laboratorní myši (obr. 6b, tab. 2). Exprese markeru nedávné/rané aktivace CD69 byla vyšší u všech podskupin NK buněk divokých myší ve srovnání s laboratorními myšmi (obr. 6c, tab. 2), ale kromě buněk stadia 1 byla exprese markeru terminální diferenciace KLRG1 spíše nižší (obr. 6, tab. 2). Tyto údaje dohromady odpovídají aktivaci, sebeobnově a homeostatické expanzi16 , a tedy vyšší míře obratu, slezinných NK buněk divokých myší ve srovnání s laboratorními myšmi.
Dále jsme zkoumali expresi rodiny Ly49 lektinových regulačních receptorů typu C na NK buňkách (obr. 6b). 6e-h) s odůvodněním, že stochastická exprese členů rodiny receptorů Ly49 na jednotlivých NK buňkách v kombinaci s genetickou rozmanitostí populace může vést k heterogenitě NK buněk v rámci jedince a k rozsáhlým rozdílům ve fenotypu NK buněk mezi jedinci11. Inhibiční receptory Ly49 rozpoznávají vlastní MHC třídy I a brání buňkám NK zabíjet zdravé buňky, zatímco receptory Ly49, které rozpoznávají ligandy spojené s patogeny, vedou k aktivaci buněk NK a zabíjení infikovaných buněk; nejlépe popsaným příkladem je vazba Ly49H na glykoprotein m157 myšího cytomegaloviru (MCMV), která zprostředkovává ochrannou imunitu vůči MCMV (ref. 17).
Analyzovali jsme expresi dvou aktivačních receptorů (Ly49D a Ly49H) a jednoho inhibičního receptoru (Ly49G2). U většiny laboratorních myší C57BL/6 exprimovaly NK buňky Ly49D, Ly49G a Ly49H (obr. 6e-h), přičemž 5-45 % NK buněk exprimovalo každý z receptorů, což odpovídá předchozím zprávám18. Naproti tomu jen velmi málo divokých myší mělo Ly49H+ NK buňky (10 %, n=125, ≥1 % Ly49H+ buněk, doplňková data 1), což naznačuje, že gen kódující tento receptor je v této populaci divokých myší vzácný nebo že alelická variabilita vylučuje rozpoznání protilátkou anti-Ly49H. Genotypizovali jsme myši v lokusu Ly49h na deleci, která je spojena s náchylností k MCMV (ref. 17), a zjistili jsme, že 18 % divokých myší bylo homozygotních pro tuto deleci (95% interval spolehlivosti 9,5-30 %, n=98 myší z HW lokality; frekvence deleční alely 0,42 za předpokladu Hardy-Weinbergovy rovnováhy). To pravděpodobně částečně přispívá k nedostatku Ly49H+ NK buněk mezi divokými myšmi, ale vyvolává to otázky ohledně přítomnosti dalších nulových alel v lokusu Ly49h a zda mohou jiné receptory kompenzovat nedostatek Ly49H u divokých myší, zejména vzhledem k vysoké prevalenci MCMV v populacích divokých myší, která se uvádí 62 a 79 % (cit.19,20). Zjevná nepřítomnost Ly49H u divokých myší může vysvětlovat jejich mnohem častější expresi alternativního aktivačního receptoru Ly49D a naznačuje, že mezi divokými a laboratorními myšmi mohou existovat významné rozdíly v podílu NK buněk na funkční imunitě.
Identifikovali jsme tři populace buněk Ly49G2: Ly49G2-, Ly49G2low a Ly49G2high (obr. 6g). Mezi divokými myšmi byla většina Ly49G2+ buněk Ly49G2low, zatímco u laboratorních myší převažovaly Ly49G2high buňky. To naznačuje přítomnost různých alel v kódujícím lokusu Ly49G2 v divoké a laboratorní populaci. Mezi laboratorními myšmi byly rozdíly v expresi receptoru Ly49G mezi kmeny spojeny s alelickými rozdíly v aktivitě promotoru21 a mohou ovlivňovat práh pro aktivaci NK buněk18. Tyto údaje podporují myšlenku, že mezi receptory Ly49 existuje rozsáhlá, dosud nedokumentovaná alelická diverzita, která má pravděpodobně důležité důsledky pro funkci NK buněk ve volné přírodě.
Chtěli jsme pochopit rovnováhu exprese aktivačních a inhibičních receptorů Ly49 na NK buňkách, a proto jsme porovnali podíly NK buněk exprimujících nebo neexprimujících Ly49D a Ly49G2 (obr. 6e). Divoké myši měly významně vyšší podíl Ly49D+G- buněk než laboratorní myši, zatímco laboratorní myši měly významně vyšší podíl Ly49D-G+ buněk než divoké myši (tab. 2), což naznačuje, že NK buňky divokých myší mohou mít nižší práh pro aktivaci, i když to bude silně ovlivněno genotypem MHC třídy I a expresí dalších Ly49 receptorů, které zde nebyly testovány. Tyto výsledky společně ukazují, že NK buňky divokých myší mohou být a jsou aktivovány mnohem snadněji než buňky laboratorních myší, což může být nutnou reakcí na vysokou zátěž patogeny ve volné přírodě.
Divoké myši mají sníženou cytokinovou odpověď na PAMPs
Vzhledem k vysoce aktivovanému stavu buněčného imunitního systému divokých myší jsme měřili funkční imunitní odpověď kultivací splenocytů v přítomnosti PAMPs (CpG, ligand pro endosomálně exprimovaný TLR9; PG, agonisty TLR2; bakteriálního LPS, ligandu pro TLR4) a mitogenu (monoklonální protilátky proti povrchovým molekulám T-buněk CD3 a CD28). Mezi 45 porovnáními provedenými mezi divokými a laboratorními myšmi (5 kultivačních podmínek × 9 cytokinů) bylo zjištěno pouze 16 významných rozdílů mezi divokými a laboratorními myšmi, přičemž u 13 z nich byly koncentrace analytů významně nižší u divokých myší (obr. 7, doplňkové údaje 1, doplňková tabulka 5). Za zmínku stojí zejména to, že divoké myši produkovaly v reakci na ligandy související s patogeny signifikantně méně IL-12 (p40 a p70) a méně IL-13 než laboratorní myši a rovněž byl zaznamenán trend k nižší produkci IL-10 u divokých myší, ačkoli to bylo signifikantní pouze na počátku. Tyto relativně snížené cytokinové odpovědi jsou ve značném kontrastu s vysoce aktivovaným stavem buněčné imunity divokých myší. Předpokládáme, že u divokých myší, které jsou chronicky a vysoce vystaveny patogenům, může fungovat určitá forma vrozené imunitní tolerance, která omezuje stupeň zánětu. Jediné cytokinové odpovědi, které byly u divokých myší významně vyšší než u laboratorních myší, byly odpovědi IFN-γ, IL-4 a MIP-2α na anti-CD3/anti-CD28, což odpovídá vyššímu podílu paměťových a efektorových T buněk u divokých myší. Tyto výsledky naznačují, že vrozené cytokinové odpovědi a jejich funkční účinky bude možná třeba u laboratorních myší přehodnotit.
Koncentrace devíti cytokinů (IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, MIP-2α) produkované slezinnými lymfocyty stimulovanými anti-CD3/anti-CD28, CpG, LPS nebo PG ve srovnání s kontrolou RPMI u divokých (stínované) a laboratorních (nestínované) myší, zobrazené ve stupnici log10. Středy boxů jsou mediány a hranice boxů 25. a 75. percentil, whiskery 1,5násobek mezikvartilového rozpětí a odlehlé hodnoty jsou znázorněny tečkami. Tečkované vodorovné čáry znázorňují medián dolní meze kvantifikace definovaný ze standardních křivek na všech analyzovaných destičkách pro každý cytokin. Hvězdičky označují významné rozdíly jako *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (Mannův-Whitneyho U test; doplňková tabulka 5). Velikosti vzorků jsou uvedeny v doplňkových údajích 1 a v doplňkové tabulce 5.
.