En fællesskabsressource

Det komplette immunologiske datasæt af 460 vilde mus leveres som en fællesskabsressource (Supplementary Data 1). Ud fra dette sammenligner vi i detaljer en delmængde af 181 vilde mus (100 hanmus, 81 hunmus) fra et enkelt sted (sted HW, Fig. 1a, Supplerende tabel 1) med 64 laboratorieopdrættede, patogenfrie C57BL/6-mus (24 hanmus, 40 hunmus). Resultaterne af denne sammenligning er vist i tabel 1,2 og supplerende tabel 2, idet sidstnævnte er for stor til at passe ind i artiklens hovedtekst.

Vildmus er immunologisk forskellige fra laboratoriemus

Serologiske og morfometriske parametre for de vilde (HW) og laboratoriemus (C57/BL6) mus er opsummeret i tabel 1. De vilde mus var meget mindre end laboratoriemusene (de vejede kun halvt så meget), og blandt de vilde mus var alder, kropslængde og masse alle stærkt korreleret (længde og masse, Pearson-korrelationer (tohalet) r=0,79; alder og masse, r≥0,77; alder og længde, r=0,58, P<0,001, n>80 for han- og hunmus separat) (Supplerende data 2). De vilde mus havde en medianalder på 6.6 uger (interval 1-39.5), og mange immunparametre korrelerede med alder og størrelse, sandsynligvis på grund af kumulativ eksponering for infektion (Supplerende data 2). Af 62 immunologiske målinger var de fleste (57 målinger) forskellige mellem vilde og laboratoriemus (Tabel 1, Tabel 2, Supplerende tabel 2). Blandt de vilde mus var der meget få (6 ud af 62 målinger) signifikante immunologiske forskelle mellem han- og hunmus, mens laboratoriemusene var mere (18 ud af 62 målinger) immunologisk kønsdimorfe (Tabel 1, Tabel 2, Supplerende tabel 2).

Multilocus-genotypning viser, at de vilde HW-mus er en ustruktureret, genetisk forskelligartet population (Fig. 1b, Supplerende data 3). De vilde mus er genetisk forskellige fra ti laboratoriemusestammer, og laboratoriestammerne er mere genetisk forskellige end de vilde mus. Vi foreslår, at dette genetiske forhold mellem de vilde mus og laboratoriemusene forklares ved mosaikisim af laboratoriemusgenomerne4 , ved at laboratoriemusene bevidst er blevet adskilt fra hinanden i mange generationer, og ved at laboratoriestammerne stort set er homozygote.

Vilde mus bærer en betydelig infektionsbyrde

Vi screenede de vilde mus for tegn på infektion med virus og Mycoplasma pulmonis og for tegn på infektion med ektoparasitter og intestinale nematoder; leverandørerne bekræftede, at laboratoriemusene var fri for infektion. Seroprevalensen af de forskellige mikrobielle infektioner varierede fra 22 % for minutvirus til 92 % for parvovirus (n=153 for begge analyser; Supplerende tabel 3). Vilde mus var almindeligvis inficeret med Oxyurid-nematoden Syphacia spp. (prævalens 91 %) og med miden Myocoptes musculinus (prævalens 82 %) (n=181 i begge tilfælde). Infektion af vilde mus var meget almindelig: alle vilde mus havde været inficeret med mindst ét patogen, og kun 5 % (8 ud af 153) var seronegative for alle virus og M. pulmonis. Der var ingen effekt af køn på intensiteten eller prævalensen af infektion (Supplerende tabel 3).

Vilde mus har meget høje koncentrationer af serumproteiner

I vilde mus var serumkoncentrationerne af IgG og IgE henholdsvis 20- og 200 gange højere hos vilde mus end hos laboratoriemusene (fig. 2). Blandt vilde mus var IgE-koncentrationerne signifikant højere hos hunner end hos hanner (tabel 1). Derimod var de fækale IgA-koncentrationer ikke signifikant forskellige mellem vilde mus og laboratoriemus (fig. 2, tabel 1). Vildmus havde også signifikant højere serumkoncentrationer af akutfaseproteinerne, serumamyloid P-komponenten (SAP) og haptoglobin end laboratoriemusene (fig. 2, tabel 1). Disse forskelle skyldtes ikke højere samlede serumproteinkoncentrationer hos vilde mus, da koncentrationerne af alfa-1-antitrypsin (AAT) – en stabil komponent i normalt serum – ikke var forskellige mellem vilde mus og laboratoriemus (fig. 2, tabel 1).

Vildmus var mere heterogene i deres koncentrationer af immunoglobuliner og akutfaseproteiner sammenlignet med laboratoriemus (Fig. 2, Tabel 1, Supplerende tabel 4). Selv om baseline SAP-koncentrationer er delvist genetisk bestemt13 , tyder den signifikante korrelation mellem SAP- og haptoglobinkoncentrationer (Pearson-korrelationer (tohalet) r=0,41, P<0,0001, r=0,33, P=0,004 for henholdsvis 96 hanner og 77 hunner; Supplerende data 2) på, at inflammation og/eller infektion er de sandsynlige drivkræfter for denne heterogenitet. Blandt vilde mus var serumkoncentrationerne af IgG og IgE signifikant, positivt korreleret med alder (Pearson-korrelation (tohalet) r>0,2, P<0,05, n≥79; Supplerende data 2), hvilket sandsynligvis afspejler kumulativ eksponering for infektion. Dette kan ses eksplicit for IgE-koncentrationer, som var signifikant positivt korreleret med antallet af mikrobielle infektioner hos vilde hanmus (Pearson-korrelation (tohalet) r=0,23, P=0,036, n=80; Supplerende data 2). Hos hunvildmus var den fækale IgA-koncentration stærkt korreleret med antallet af mikrobielle infektioner og med antallet af mider (mikrobielle infektioner Pearson-korrelationer (tohalet) r=0,58, P<0,0001, n=35; antal mider r=-0,380, P=0,01, n=45; Supplerende data 2).

Vilde muses splenocytter adskiller sig fra laboratoriemusene

Spleenerne hos vilde mus var meget mindre (ca. en tredjedel af massen) end hos laboratoriemusene og indeholdt betydeligt færre (ca. en femtedel af antallet) levedygtige mononukleære leukocytter (tabel 1). Mere overraskende var milten hos vilde mus signifikant proportionelt mindre (dvs. sammenlignet med kropsmassen) end hos laboratoriemusene (tabel 1).

Ex vivo flowcytometrisk kvantificering og karakterisering af miltcellepopulationer (fig. 3, 4, 5, 5, 6, Supplerende fig. 1) viste, at de vilde mus havde lavere absolutte antal T-celler, B-celler, NK-celler, dendritiske celler, makrofager og neutrofile end laboratoriemusene, hvilket er i overensstemmelse med deres lavere absolutte antal af mononukleære celler i milten (Supplerende data 1). Men proportionelt set havde vilde mus’ miler betydeligt flere T-celler, et højere T:B-celleforhold og flere CD11b+ myeloide celler, men færre NK-celler og dendritiske celler end laboratoriemusene (Supplerende tabel 2); forholdet mellem CD4+: CD8+ T-celler var også signifikant højere hos vilde mus end hos forsøgsmus. Disse forskelle er i overensstemmelse med ophobning af T-hjælperceller og fagocytiske celler i milten hos vilde mus som reaktion på systemiske infektioner.

Status af CD4+ og CD8+ T-celler var markant forskellig mellem vilde mus og laboratoriemus. For CD4+ T-celler var signifikant større andele effektor/effektorhukommelsesceller (CD62L- CD44hi) og centrale hukommelsesceller (CD62L+ CD44hi) (og således forholdsmæssigt færre var naive, CD62L+ CD44low), hos vilde mus sammenlignet med laboratoriemus (Supplerende tabel 2, fig. 3a). Selv om andelen af CD4+ T-celler, der var Foxp3+ CD25+ Treg-celler, var marginalt højere blandt vilde mus end blandt laboratoriemusene (Supplerende tabel 2, fig. 3b), var dette ikke tilstrækkeligt til at opveje den meget større andel af effektor-CD4+ T-celler, således at forholdet mellem effektor-CD4+ T-celler og Tregs var signifikant højere blandt vilde mus end blandt laboratoriemusene (Supplerende tabel 2).

Sådan havde vilde mus for CD8+ T-celler en signifikant højere andel af effektor/effektorhukommelsesceller (CD62L- CD44hi) og terminalt differentierede (KLRG1+) celler end laboratoriemusene (og dermed signifikant lavere andele af naive) (Fig. 3c,d). Vilde mus havde også forholdsmæssigt færre centrale memory (CD62L+ CD44hi) CD8+ T-celler (CD62L+ CD44hi) end laboratoriemusene; denne forskel skyldtes til dels den lave frekvens af disse celler i vilde hanmus (Supplerende tabel 2), men kan også afspejle den relative fordeling af antigenerfarne CD8+ T-celler mellem memory- og effektorsubsættene. Igen var forholdet mellem effektor/effektor-hukommelses-CD8+ T-celler og Tregs betydeligt højere hos vilde mus end hos laboratoriemus (Supplerende tabel 2).

Konsistent med ideen om, at hyppig eller vedvarende patogenudfordring driver ekspansion af antigenerfarne CD4+ og CD8+ T-celleundergrupper i vilde mus, var der signifikante positive korrelationer mellem andelen af effektor-CD4+ og CD8+ T-celler og alder blandt vilde hunmus (Pearsonkorrelationer (tohalet) alder og effektor-CD4+ r=0,62, P<0,0001, n=51; alder og effektor CD8+ r=0,49, P<0,0001, n=50; Supplerende data 2). Interessant nok var disse parametre ikke stærkt korreleret med alder hos vilde hanmus (Pearson-korrelation (tohalet) r<0.1, P>0.05, n=66), hvilket peger på forskellige immunologiske strategier hos han- og hunmus i naturen.

I modsætning til den højt primede/effektorstatus af spleniske T-celler, havde CD19+ B-lymfocytter af vilde mus overvejende en naiv fænotype. Vi kategoriserede miltære CD19+ B-lymfocytter som naive (CD38+ IgD+), hukommelsesceller (CD38+ IgD- GL7-) eller celler fra germinalcentre (CD38lo IgD- GL7hi)14 og identificerede nyligt aktiverede, antigenerfarne celler ved deres MHC-klasse II-ekspression og binding af jordnøddeagglutinin (PNA; hvilket indikerer ekspression af PNA-receptoren, PNA-R)15 (Fig. 4a). På trods af deres meget høje serumimmunoglobulinkoncentrationer indeholdt milten hos vilde mus betydeligt højere andele af naive B-celler (og omvendt betydeligt lavere andele af hukommelses-B-celler) end hos laboratoriemusene (Fig. 4b,c). Denne i første omgang kontraintuitive observation afspejler sandsynligvis reallokering af antigenerfarne B-celler fra milten til knoglemarven, til andre lymfoide væv eller til infektionssteder sammen med en kontinuerlig genbefolkning af milten med naive, fra knoglemarven afledte B-celler. Vilde mus havde forholdsmæssigt flere B-celler fra germinalcentre i deres milt end laboratoriemusene, og PNA-bindingen var forholdsvis højere på alle B-celleundergrupper i vilde mus, hvilket er i overensstemmelse med nylig aktivering15 (Fig. 4d, Supplerende tabel 2). Tilsammen peger disse resultater på en høj omsætning af aktiverede CD19+ B-celler i vilde muses miltceller.

Vilde mus har en hidtil ukendt myeloid cellepopulation

Vi identificerede herefter myeloide celler som CD11b+ CD11c- (Fig. 5a) og analyserede deres udtryk af F4/80 og Ly6G, hvilket afslørede fire subpopulationer af F4/80+ celler, betegnet M1-M4 (Fig. 5b-d). Disse omfatter F4/80+ Ly6G- (M1) vævsresidente makrofager, F4/80+ Ly6Glow (M2) monocytter/røde pulpmakrofager og F4/80+/-Ly6Ghigh (M4) polymorphonukleære celler (PMN). M4 PMN-populationen kunne yderligere opdeles i neutrofiler og myeloidderiverede suppressorceller på grundlag af deres fremadrettede og sidedispredningskarakteristika (fig. 5e). Det er vigtigt, at vi i vilde mus, men ikke i laboratoriemus, identificerede en yderligere population af F4/80+ celler, der udtrykker niveauer af Ly6G, som ligger mellem monocytter/makrofager og PMN (M3). Så vidt vi ved, er der tale om en ny population af celler, som ikke tidligere er beskrevet, og som vi har kaldt hyper-granulocytære myeloide celler (HGMC) på grundlag af deres fremadrettede og side scatter-karakteristika (Fig. 5c-e). Selv om der er nogle små forskelle i niveauet af Ly6G-ekspression mellem M2- og M3/M4-populationerne i vilde og laboratoriemus (Fig. 5c), bekræftede back gating af hver population på CD11b, CD11c og fremadrettet og side scatter, at M2-populationerne i vilde og laboratoriemus ellers er identiske, og at den Ly6Ghigh-population i laboratoriemus svarer til M4-populationen i vilde mus (Fig. 5d). En sammenligning af sidespredningen for hver population bekræfter også, at den hypergranulocytære M3-population med høj sidespredning faktisk kun ses hos vilde mus (fig. 5f). Den funktionelle betydning af disse celler er endnu ukendt, men deres opdagelse understreger, at undersøgelse af laboratoriemus ikke nødvendigvis afslører immunsystemets fulde armamentarium.

Vildmusene havde ikke blot forholdsmæssigt flere CD11b+ CD11c- myeloide celler i deres milt end laboratoriemusene, men inden for den myeloide population var PMN og HGMC beriget på bekostning af makrofager og monocytter (Fig. 5a,f, Supplerende tabel 2). Ekspansionen og/eller ophobningen af neutrofile og HGMC i milt hos vilde mus er i overensstemmelse med nylig eller aktuel eksponering for infektion hos vilde mus. Milte CD11c+ dendritiske celler var forholdsmæssigt sjældnere hos vilde mus sammenlignet med laboratoriemus (Fig. 5g, Supplerende tabel 2).

Vildmus NK-celler er stærkt aktiverede

Vi karakteriserede NKp46+ CD3ɛ- NK-celler (Fig. 6) som tidlige (stadie 1), midterste (stadie 2), sene (stadie 3) eller fuldt modne (stadie 4) celler ved udtryk af CD27 og CD11b (Fig. 6a). Vilde mus havde højere andele af celler i stadium 1 og stadium 2 og lavere andele af NK-celler i stadium 3 og stadium 4 i milt, hvilket resulterede i et betydeligt højere forhold mellem tidlige/mellemstadie NK-celler og sene/modne NK-celler end laboratoriemusene (Fig. 6b, Tabel 2). Ekspressionen af den nylige/tidlige aktiveringsmarkør CD69 var højere på alle undergrupper af NK-celler fra vilde mus sammenlignet med forsøgsmus (Fig. 6c, Tabel 2), men – bortset fra på stadium 1-celler – var ekspressionen af KLRG1-markøren for terminal differentiering generelt lavere (Fig. 6, Tabel 2). Tilsammen er disse data i overensstemmelse med aktivering, selvfornyelse og homeostatisk ekspansion16 , og dermed højere omsætningshastigheder, af miltære NK-celler fra vilde mus sammenlignet med laboratoriemus.

Vi undersøgte dernæst ekspressionen af Ly49-familien af C-type lektinregulerende receptorer på NK-celler (Fig. 6e-h) med den begrundelse, at stokastisk ekspression af Ly49-receptorfamiliens medlemmer på individuelle NK-celler kombineret med populationsgenetisk diversitet kan føre til NK-celleheterogenitet inden for et individ og omfattende variation i NK-cellefænotype mellem individer11. Inhiberende Ly49-receptorer genkender selv-MHC klasse I og forhindrer NK-celler i at dræbe sunde celler, mens Ly49-receptorer, der genkender patogen-associerede ligander, fører til NK-celleaktivering og dræbning af inficerede celler; det bedst beskrevne eksempel på dette er binding af Ly49H til murin cytomegalovirus (MCMV) m157-glykoproteinet, som formidler beskyttende immunitet over for MCMV (ref. 17).

Vi analyserede ekspressionen af to aktiverende receptorer (Ly49D og Ly49H) og en hæmmende receptor (Ly49G2). For de fleste C57BL/6-laboratoriemus udtrykte NK-celler Ly49D, Ly49G og Ly49H (fig. 6e-h) med 5-45 % af NK-cellerne, der udtrykker hver af receptorerne, hvilket stemmer overens med tidligere rapporter18. I modsætning hertil havde meget få vilde mus Ly49H+ NK-celler (10 %, n=125, ≥1 % af Ly49H+-cellerne, Supplerende data 1), hvilket tyder på, at genet, der koder for denne receptor, er sjældent i denne vilde musepopulation, eller at allelisk variation udelukker genkendelse med anti-Ly49H-antistoffet. Vi genotypede mus ved Ly49h locus for en deletion, der er forbundet med modtagelighed for MCMV (ref. 17), og fandt, at 18% af de vilde mus var homozygote for denne deletion (95% konfidensinterval 9.5-30%, n=98 mus fra HW-stedet; hyppighed af deletionsallel 0.42 under antagelse af Hardy-Weinberg ligevægt). Dette bidrager sandsynligvis delvist til knapheden af Ly49H+ NK-celler blandt vilde mus, men rejser spørgsmål om tilstedeværelsen af yderligere nulalleler på Ly49h-lokus, og om andre receptorer kan kompensere for manglen på Ly49H i vilde mus, især i betragtning af den høje prævalens af MCMV i de vilde musepopulationer, der rapporteres at være 62 og 79% (refs 19, 20). Den tilsyneladende mangel på Ly49H blandt de vilde mus kan forklare deres meget hyppigere udtryk for den alternative aktiverende receptor Ly49D og antyder, at der kan være vigtige forskelle mellem vilde mus og laboratoriemus i NK-cellernes bidrag til funktionel immunitet.

Vi identificerede tre populationer af Ly49G2-celler: Ly49G2-, Ly49G2low og Ly49G2high (Fig. 6g). Blandt vilde mus var de fleste Ly49G2+ celler Ly49G2low, mens Ly49G2high celler dominerede hos laboratoriemusene. Dette tyder på tilstedeværelsen af forskellige alleler på det Ly49G2-kodende locus i de vilde og laboratoriepopulationer. Blandt laboratoriemusene er forskelle mellem stammerne i Ly49G-receptorekspression blevet forbundet med allelisk variation i promotoraktivitet21 og kan påvirke tærsklen for NK-celleaktivering18. Disse data understøtter ideen om, at der er omfattende, hidtil udokumenteret, allelisk diversitet blandt Ly49-receptorer med sandsynligvis vigtige konsekvenser for NK-cellefunktionen i naturen.

Vi ønskede at forstå balancen i ekspressionen af aktiverende og hæmmende Ly49-receptorer på NK-celler og sammenlignede derfor andelene af NK-celler, der udtrykker eller ikke udtrykker Ly49D og Ly49G2 (Fig. 6e). Vilde mus havde signifikant højere andele af Ly49D+G- celler end laboratoriemusene, mens laboratoriemusene havde signifikant højere andele af Ly49D-G+ celler end vilde mus (Tabel 2), hvilket tyder på, at NK-celler hos vilde mus kan have en lavere tærskel for aktivering, selv om dette vil være stærkt påvirket af MHC klasse I-genotypen og ekspression af andre Ly49-receptorer, der ikke er undersøgt her. Tilsammen viser disse resultater, at NK-celler hos vilde mus kan aktiveres og aktiveres meget lettere end hos laboratoriemus, hvilket kan være en nødvendig reaktion på den høje patogenbelastning i det vilde miljø.

Vildmus har reduceret cytokinrespons på PAMPs

I lyset af den højt aktiverede tilstand af det cellulære immunsystem hos vilde mus målte vi det funktionelle immunrespons ved at dyrke splenocytter i nærvær af PAMPs (CpG, ligand for endosomalt udtrykt TLR9; PG, en TLR2-agonist; bakteriel LPS, en ligand for TLR4) og et mitogen (monoklonale antistoffer mod T-celleoverflademolekylerne CD3 og CD28). Blandt de 45 sammenligninger, der blev foretaget mellem vilde mus og laboratoriemus (5 kulturbetingelser × 9 cytokiner), blev der kun observeret 16 signifikante forskelle mellem vilde mus og laboratoriemus, og i 13 af disse var analytkoncentrationerne signifikant lavere hos de vilde mus (Fig. 7, Supplerende data 1, Supplerende tabel 5). Det skal især bemærkes, at vilde mus producerede signifikant mindre IL-12 (p40 og p70) og mindre IL-13 end laboratoriemusene som reaktion på patogenrelaterede ligander, og der var også en tendens til, at IL-10-produktionen var lavere hos vilde mus, selv om dette kun var signifikant ved baseline. Disse forholdsvis lavere cytokinresponser står i betydelig kontrast til den højt aktiverede cellulære immuntilstand hos vilde mus. Vi spekulerer i, at en form for medfødt immuntolerance kan virke for at begrænse graden af inflammation hos kronisk og stærkt patogeneksponerede vilde mus. De eneste cytokinresponser, der var signifikant højere hos vilde mus end hos forsøgsmus, var IFN-γ-, IL-4- og MIP-2α-responserne på anti-CD3/anti-CD28, hvilket er i overensstemmelse med de højere andele af hukommelses- og effektor-T-celler hos vilde mus. Disse resultater tyder på, at de medfødte cytokinresponser og deres funktionelle virkninger måske skal revurderes i laboratoriemus.