Souris
Toutes les procédures animales et tous les travaux sur les souris ont été approuvés par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université agricole de Chine (numéro de permis : SKLAB-2016-01-04). Les souris CD1 et 129 ont été obtenues auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Les souris Actin-GFP ont été obtenues auprès du laboratoire de Shaorong Gao de l’Université de Tongji. Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes de pathogènes spécifiques (SPF) avec un cycle de 12 heures d’obscurité / 12 heures de lumière entre 06h00 et 18h00 dans une pièce à température contrôlée (22 ± 2 °C) avec un accès libre à l’eau et à la nourriture.
Lignes de cellules souches et culture cellulaire
Les ESC G4 et G4-ACTB-DsRed-MST ont été obtenues auprès du laboratoire du Dr Andras Nagy, de Kristina Vintersten et de Marina Gertsenstein à l’hôpital Mount Sinai & l’Institut de recherche Samuel Lunemfeld. La lignée ESC doublement transgénique Blimp1-mVenus et Stella-ECFP (BVSC), exprimant Venus ciblée sur la membrane (mVenus) sous le contrôle des éléments régulateurs Prdm1 (Blimp1) et le CFP amélioré (ECFP) sous le contrôle de Dppa3 (Stella/Pgc7), a été obtenue auprès du Dr Mitinori Saitou45,46.
Pour la génération de la lignée cellulaire XEN de souris Lefty1-mCherry, le promoteur Lefty1 et la protéine fluorescente ont été utilisés pour être intégrés dans les cellules XEN par le système transposon Sleeping Beauty, qui consiste en deux composants : le vecteur transposon modifié à partir de pT2/LTR7-GFP (addgene#62541) et le vecteur transposase (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879). PT2/LTR7-GFP a été ajouté avec le château « puro », qui pourrait exprimer la puromycine N-acétyltransférase et la région CDS de la GFP a été remplacée par mCherry. Le fragment d’ADN, qui a été amplifié à partir de pT2/LTR7-GFP par l’amorce PT2-F (GTTTGGACAAACCACAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACATCATTTTCTG), a été couplé avec le château « puro » et la région CDS de mCherry pour obtenir le vecteur nommé PT2-Puro-mCherry en utilisant NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs). La séquence du promoteur du gène Lefty1 a été amplifiée à partir de l’ADN de cellules ES de souris en utilisant Lefty1-F (GTCCGGTGGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTTGAGTCTGCGG). Ensuite, la séquence du promoteur du gène Lefty1 a été ajoutée à PT2-Puro-mCherry par NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs), dans lequel PT2-Puro-mCherry a été linéarisé par EcoRI et la séquence de chevauchement contenant la séquence EcoRI a été ajoutée à la séquence du promoteur du gène Lefty1. Le vecteur a été nommé PT2-Puro-mCherry-Lefty1. Ensuite, PT2-Puro-mCherry-Lefty1 et pCMV(CAT)T7-SB100 ont été transfectés dans des cellules XEN de souris et criblés par 2 μg par mL de puromycine pour des analyses ultérieures.
Pour la génération de lignées cellulaires knockout Lamc1 (laminine, gamma 1), deux séquences sgRNA ciblant (GGAGTACTGCGTGCAGACTGGGG et GCTTTGCCACCAGGTGGTGTCGG) l’exon1 de Lamc1 ont été utilisées pour construire un vecteur sgRNA double. Les fragments contenant deux séquences sgRNA ont été amplifiés à partir de PUC-U6-sgRNA-Kana (du laboratoire de Huang Xingxu) en utilisant des amorces (Lamc1sg1-F : atgcgtctcacggagtactgcgtgcagactggttttagagctagaaatagcaag et Lamc1sg2-R : atgcgtctcgaaacacaccacctggtggcaaagcggtgtttcgtcctttccacaag). Le produit PCR a été digéré avec BsmbI et ligaturé avec PX330-GFP linéarisé. Les vecteurs ont été transfectés dans les ESC et les XENC en utilisant la Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific), respectivement. Ensuite, les cellules positives pour la GFP ont été triées par cytométrie de flux et diluées pour la croissance monoclonale. L’ADN a été extrait des cellules monoclonales obtenues et soumis à une amplification par PCR et à un séquençage. Les cellules knockout-positives ont été sélectionnées pour des expériences de suivi.
Pour la génération de lignées cellulaires knockout de Nodal, la séquence gRNA ciblant (GCCCTCGTCACCGTCCCCTGG) l’exon1 de Nodal a été utilisée pour construire le vecteur sgRNA. Les amorces pour le sgRNA de Nodal (Nodal-sgF : caccgccctcgtcaccgtcccctc et Nodal-sgR : aaacgaggggacggtgacgagggc) ont été recuites et le produit recuit a été ligaturé à la PX330-GFP linéarisée par BbsI. Les vecteurs ont été transfectés dans des ESC en utilisant la Lipofectamine 3000 et les cellules positives pour la GFP ont été triées en utilisant la cytométrie de flux et diluées pour la croissance monoclonale. L’ADN a été extrait des cellules monoclonales obtenues et soumis à une amplification par PCR et à un séquençage. Les cellules knockout-positives ont été sélectionnées pour des expériences de suivi.
Pour la génération de la lignée ESC knockout p53, la séquence sgRNA pour la mutation p53 a été clonée dans le vecteur PX330-GFP (addgene, #48138) en utilisant le système CRISPR-Cas959. Le vecteur a été transfecté dans des ESC G4 par Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Trois jours après la transfection, les cellules positives pour la GFP ont été triées et placées sur des plaques à 6 puits. Les colonies ont été prélevées et les régions knockout ont été amplifiées par PCR à l’aide d’amorces (F : CATCCAGGCGGGAAATAGAGAC ; R : CCTGACTGTGTGTAAACTAGGC) et séquencées. En s’alignant avec la séquence de type sauvage, des colonies de cellules knockout homozygotes ont été identifiées et sélectionnées pour une étude plus approfondie.
Les CSE ont été cultivées dans un milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) avec 15% (v/v) de FBS (Gibco, qualifié de cellules ES), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoéthanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM acides aminés non essentiels (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM pyruvate de sodium (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% pénicilline-streptomycine (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1000 UI LIF (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM PD0325901 (4423, Tocris), et 3 µM CHIR99021 (4192, Tocris). Les CSE ont été cultivées à 37 °C et 5 % de CO2 sur des plaques à puits de qualité culture tissulaire gélatinisées et recouvertes de feeder, et passées lorsque 80 % de confluence est atteint.
Les CSE ont été dérivées de blastocystes E3.5 expulsés de l’utérus de souris CD1 femelles âgées de 5 semaines15,60. Les blastocystes ont été cultivés sur des cellules MEF de souris inactivées mitotiquement (cellules nourricières) avec un milieu de culture TSC : RPMI 1640 avancé (11875-093, Thermo Fisher Scientific) complété par 20% (v/v) de FBS (Gibco, qualifié pour les cellules ES), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoéthanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM pyruvate de sodium (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% (v/v) pénicilline-streptomycine (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng par mL de FGF4 humain recombinant (235-F4-025, R&D) et 1 µg par mL d’héparine (07980, Stem Cell). Jusqu’à ce que les excroissances se forment au jour 4, elles ont ensuite été désagrégées par incubation dans de la trypsine-EDTA à 0,1% pendant 5 min dans l’incubateur. Ajouter du milieu frais conditionné par des fibroblastes embryonnaires de souris à 70% contenant du FGF4 et de l’héparine pour arrêter la réaction et remettre dans l’incubateur. Remplacer le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que des colonies de cellules TS puissent être observées, et changer le milieu avec du milieu de culture TSC pour maintenir les cellules. Les lignées cellulaires TSC exprimant l’EGFP (TSC-EGFP) ont été dérivées de TSC de type sauvage qui ont été transfectées avec le vecteur PB-UBC-EGFP par JetPrime (114-15, Polyplus transfection). Les TSC ont été cultivées à 37°C et à 5 % de CO2 sur des plaques à puits de qualité culture tissulaire recouvertes de gélatine et de feeder, et ont été transférées lorsque 80 % des cellules étaient confluentes. Le milieu de culture a été changé quotidiennement.
Les XENC ont été dérivés de blastocystes E3.5 expulsés de l’utérus de souris femelles 129 âgées de 5 semaines en utilisant des conditions XENC modifiées61. Les blastocystes de souris ont été cultivés sur des cellules nourricières jusqu’à ce qu’ils forment une excroissance au jour 4, qui a ensuite été désagrégée par incubation dans de la trypsine-EDTA à 0,1 % pendant 5 minutes dans l’incubateur. Ajouter du milieu frais pour cellules ES de souris sans PD0325901 et CHIR99021 pour arrêter la réaction, et remplacer le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que des colonies de cellules XEN puissent être observées. Les colonies de cellules XEN ont été maintenues avec le milieu standard XEN : RPMI 1640 avancé (11875-093, Thermo Fisher Scientific) complété par 15% (v/v) de FBS (Gibco) et 0,1 mM de β-mercaptoéthanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1% de pénicilline-streptomycine (15140122, Thermo Fisher Scientific). La lignée cellulaire XENC-EGFP a été dérivée directement du blastocyste de souris Actin-EGFP. Pour la culture sans nourrice, les XENC ont été maintenues sur des plaques à puits de qualité culture tissulaire recouvertes de gélatine. Les cellules XEN ont été cultivées à 37 °C et 5 % de CO2. Elles ont été transférées une fois qu’elles ont atteint 90% de confluence. Le milieu de culture a été changé quotidiennement.
Génération d’embryons auto-assemblés
Les CSE, qui ont atteint 80% de confluence, ont été lavés une fois avec du PBS (14190-094, Gibco) et ont été incubés pendant 5 min à 37 °C dans TrypLE (12605010, Thermo Fisher Scientific). Les TSC et les XENC ont été dissociés en cellules uniques par incubation avec de la trypsine-EDTA à 0,1 % (25300054, Thermo Fisher Scientific) à 37 °C. Les cellules ont été pelletées par centrifugation à 1000 rpm pendant 5 minutes. Le culot a été remis en suspension dans le milieu pour embryons reconstitués par pipetage pour obtenir des cellules uniques. Les cellules ont été comptées automatiquement avec un compteur de cellules automatisé.
Pour les embryons ETX, mélanger les CSE, les CST et les XNEC à un nombre de cellules de 1 × 105, 1 × 105 et 2 × 105, respectivement (pour les embryons ETS, mélanger les CSE et les CST à un nombre de cellules de 1 × 105 et 1 × 105, respectivement ; pour les embryons EXE, mélanger des CSE et des XENC à un nombre de cellules de 1 × 105 et 1 × 105, respectivement) avec 2 mL de milieu pour embryons reconstruits par boîte de culture cellulaire de 35 mm non traitée. Déplacer la boîte sur les rotateurs horizontaux à 37 °C, 5 % de CO2 et 100 % d’humidité. La vitesse de rotation est de 60 rpm par minute. Le milieu pour embryons reconstruits comprend 39% de RPMI 1640 avancé (11875-093, Thermo Fisher Scientific) et 39% de DMEM (11960069, Thermo Fisher Scientific) avec 17,5% de FBS (Gibco, qualifié pour les cellules ES), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM de β-mercaptoéthanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM d’acides aminés non essentiels MEM (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM de pyruvate de sodium (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% de pénicilline-streptomycine (15140122, Thermo Fisher Scientific). Changer le milieu avec 2 mL de milieu d’embryon reconstruit frais chaque jour.
Les embryons ETX se sont formés de manière cohérente et efficace, les expériences fonctionnelles peuvent être réalisées sans sélection de structures régulières ou irrégulières. Pour les expériences fonctionnelles des ETX-embryoïdes et des ETS-embryoïdes, nous avons sélectionné les structures régulières en fonction de leur morphologie, et les proportions et positions appropriées des compartiments ESC et TSC par l’indication de TSC-EGFP sous stéréo microscope à fluorescence.
Récupération des embryons de type sauvage et culture in vitro
Les blastocystes ont été récupérés à partir de souris femelles gestantes superovulées E4,5 par rinçage utérin avec du M2 (MR-015-D, Millipore). Culture des embryons en milieu IVC après élimination du trophectoderme mural in vitro sur des μ-Slides 8 puits (80826, Ibidi)62. Pour la récupération des embryons E5.5, E5.75, et E6.5, la dissection de la decidua de l’utérus décrit comme le protocole rapporté63. Pour EPI-explants de souris CD1 ont été disséqués au jour E5,0 comme précédemment rapporté28 et cultivé avec ETX-embryoïdes milieu in vitro.
Immunofluorescence coloration
Embryons de souris et les embryons reconstruits ont été fixés avec 4% de paraformaldéhyde (DingGuo, AR-0211) à 4 ° C pendant 20 min et lavés trois fois avec un tampon de lavage (PBS contenant 0,1% Tween-20). Ensuite, les embryons ont été perméabilisés avec du Triton X-100 à 0,5 % (H5142, Promega) pendant 30 minutes à température ambiante et ont été incubés avec des anticorps primaires dans un tampon de blocage (3 % BSA, 0,3 % Triton X-100) pendant une nuit à 4 °C. Après avoir été lavées pour éliminer les anticorps primaires non liés, les cellules ont été incubées avec un anticorps secondaire dans un tampon de blocage pendant la nuit à 4 °C. Les noyaux cellulaires ont été colorés avec du DAPI, suivi de deux lavages avec du tampon de lavage, puis ont été montés dans du Fluoroshield Mounting Medium avec DAPI (104140, abcam). Les images ont été capturées avec un microscope confocal Nikon A1.
Imagerie avec traitement et analyse
Les images des embryons de souris et des embryons reconstruits ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal Nikon A1 avec un objectif 20 × ou 40 ×. Toutes les analyses ont été réalisées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image open-source »Fiji ». Le volume des tissus et le nombre de cellules pour les embryons reconstruits et les embryons de type sauvage ont été estimés et les mesures d’intensité d’immunofluorescence pour l’analyse de la distribution des PCX ont également été effectuées en utilisant le logiciel Fiji9.
High-throughput single-cell qPCR et traitement des données
Pour l’isolement des cellules uniques, certaines cellules à différents stades de développement (0, 24 et 84 h) ont été recueillies à partir de deux types d’ETX-embryoïdes, qui ont été reconstruits avec Lefty1-mCherry XENC (LC-ETX-embryoïdes) et BVSC ESC (BVSC-ETX-embryoïdes) lignes de cellules rapporteur, respectivement. Pour isoler les cellules uniques, nous sélectionnons uniquement les embryons LC-ETX avec des tissus de type DVE/AVE identifiés par l’expression asymétrique des protéines mCherry, et nous sélectionnons les embryons BVSC-ETX avec une expression asymétrique des protéines mVenus dans le compartiment ESC près de la limite entre les compartiments ESC et TSC. Pour les embryons LC-ETX, des cellules dérivées de CSE LC négatives à 0, 24 et 84 h (LC- XEN) ainsi que des CSE positives à 84 h (BVSC+ ES) du côté opposé de LC- XEN ont été collectées. Pour les embryons BVSC-ETX, on a collecté des cellules dérivées de CSE BV négatives (BVSC- ES) à 0, 24 et 84 heures, ainsi que des CSE positives à 84 heures (BVSC+ ES) du côté opposé de BVSC- ES. En outre, les cellules uniques des compartiments TSC dans les ETX-embryoïdes assemblés avec des BVSC-ESC à 0, 24 et 84 h ont été collectées sur la base du reporter EGFP.
Pour la séparation des cellules uniques, tous les ETX-embryoïdes ont été incubés dans de la trypsine-EDTA à 0,1% (Invitrogen, Carlsbad, USA) pendant 5 min à 37 °C, puis transférés dans un milieu M2 (MR-015-D, Millipore). Après plusieurs pipetages doux et répétés à la bouche, des cellules uniques ont été isolées à l’aide d’un embout en verre finement tiré. En moyenne, 30-40 cellules ont été collectées pour chaque type. Chaque cellule a été lavée trois fois dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, États-Unis) contenant 0,1 % de BSA (Sigma-Aldrich, MO, États-Unis), et placée dans un mélange maître de transcription inverse-réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR) pour la lyse, la transcription inverse spécifique à la séquence et la pré-amplification, comme décrit dans le rapport précédent64.
Pour la conception et la validation des amorces, les gènes qui régulent la différenciation du lignage cellulaire (principalement du stade E3,5 à E6,5) et participent à la voie de signalisation dominante (par ex, Wnt, voie de signalisation Nodal) ont été sélectionnés, en fonction de l’embryogenèse de la souris. Les séquences d’ARNm de chaque gène concerné ont été extraites du NCBI et seules les régions communes ont été utilisées pour les gènes ayant des transcrits différents. Les amorces qRT spécifiques aux gènes ont été conçues avec le logiciel Primer3 dans une longueur de 100-250 pb. Toutes les amorces avaient été testées en utilisant l’ADNc d’embryons de souris (mélange de E5,5 et E6,5) pour l’efficacité et la spécificité de l’amplification (listées dans les données supplémentaires 1).
Pré-amplification spécifique de la séquence sur une seule cellule similaire au rapport précédent65. Un total de 96 ensembles d’amorces a été regroupé à une concentration finale de 0,1 μM pour chaque amorce. Les cellules individuelles isolées des embryons ont été transférées dans des microtubes stériles chargés de 5 μL de mélange maître de RT-PCR contenant 2,5 μL de mélange réactionnel CellsDirect (Invitrogen, Carlsbad, États-Unis), 0,5 μL de pool d’amorces, 0,1 μL d’enzyme RT/Taq (Invitrogen, Carlsbad, États-Unis) et 1,9 μL d’eau sans nucléase (Invitrogen, Carlsbad, États-Unis) dans chaque tube. Les tubes ont été immédiatement congelés sur de la glace sèche. Après une brève centrifugation à 4 °C, les tubes ont été immédiatement placés dans la machine PCR. Les lyses cellulaires et les transcriptions inverses spécifiques des séquences ont été réalisées à 50 °C pendant 1 h. Ensuite, l’inactivation de la transcriptase inverse et l’activation de la Taq polymérase ont été réalisées en chauffant à 95 °C pendant 3 min. Ensuite, dans le même tube, l’ADNc a subi 20 cycles d’amplification spécifique de la séquence par dénaturation à 95 °C pendant 15 s, puis par hybridation et élongation à 60 °C pendant 15 min. Pour éviter l’évaporation, les produits obtenus ont été stockés à -80 °C.
Pour la PCR quantitative microfluidique à haut débit sur cellule unique, tous les produits d’ADNc préamplifiés ont été validés par le système de PCR en temps réel (ABI 7500) en utilisant le gène témoin endogène Actinb, seule la valeur de franchissement de seuil (Ct) comprise entre 9 et 12 a été sélectionnée pour l’expérience suivante. Les échantillons unicellulaires amplifiés ont été analysés avec le SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX (Bio-Rad, Californie, États-Unis) et des amorces qPCR individuelles dans des tableaux dynamiques 96 × 96 sur un Biomark System (Fluidigm, San Francisco, États-Unis). Le calcul des valeurs Ct a été effectué avec le logiciel d’analyse PCR en temps réel BioMark (Fluidigm, San Francisco, États-Unis).
Pour le traitement et la visualisation des données sur une seule cellule, toutes les valeurs Ct brutes obtenues à partir du système BioMark ont été converties en niveaux d’expression relative Log2 en soustrayant les valeurs de la valeur Ct de fond supposée de 26. Les échantillons présentant une expression faible ou absente des gènes de contrôle endogènes (Actinb et Gapdh) ont été exclus des analyses ultérieures. PLS-DA a été appliqué aux données d’expression pour distinguer les groupes de cellules dans les différents embryons ETX avec le package R mixOmics66. Un regroupement hiérarchique a été effectué en utilisant les distances euclidiennes, et des dendrogrammes ont été affichés le long des cartes thermiques échelonnées en ligne en utilisant le paquet fluidigmSC. Les box-plots et les diagrammes de violon ont été générés avec les logiciels origin 8.6 et R.
Production d’embryons ESC-Chimères BVSC
Nous avons produit les embryons ESC-Chimères BVSC par la méthode d’injection d’embryons à 8 cellules par micromanipulation piézoélectrique67. Pour s’assurer que les embryons hôtes ont été injectés avant la compaction, nous avons recueilli les embryons au stade de deux cellules et les avons cultivés in vitro. Pour obtenir des embryons au stade de deux cellules, des souris femelles âgées de 5 semaines ont été superovulées par injection intrapéritonéale de cinq unités internationales (UI) de PMSG, suivie de 5 UI de HCG 46-48 heures plus tard, et accouplées avec des souris mâles. Les embryons au stade de deux cellules ont été recueillis par rinçage de l’oviducte avec du M2 à E1,5. Les embryons ont été lavés dans du M2 (MR-015-D, Millipore) puis transférés dans des gouttes de 10 μL de KSOM (MR-020P-5F, Millipore) recouvertes d’huile minérale sur une boîte de culture de tissus. Les embryons ont été maintenus à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un incubateur.
Une quinzaine de cellules ES ont été injectées dans des embryons au stade 8 cellules par micromanipulation piézoélectrique67,68. Des femelles CD1 de huit semaines accouplées à des mâles vasectomisés ont été utilisées comme souris pseudo-gestantes. Les blastocystes injectés ont été transférés dans l’utérus des femelles pseudo-gémellaires à 2,5 jours après le coïtum (dpc). Les embryons au stade de morula avec des CSE injectées ont été transférés dans l’oviducte de receveuses à 0,5 dpc. Nous avons transféré 14-16 embryons par receveuse. À E6,5, nous avons recueilli les embryons chimériques des déciductes comme décrit ci-dessus.
Transfert d’embryons et évaluation de l’implantation
Des femelles CD1 âgées de huit semaines accouplées à des mâles vasectomisés ont été utilisées comme souris pseudo-gestantes. Pour les embryons reconstruits, des sphères reconstruites à 36 h (embryons ETX-, ETS- et EXE-) ont été transférées dans les cornes utérines de souris femelles CD1 réceptrices pseudopregnantes à 2,5 dpc ou 3,5 dpc. Seize à vingt embryons ont été transférés par receveuse. Les sites d’implantation au jour 6,5 ont été identifiés et comptés par injection intraveineuse de 100 μL de solution de Chicago Sky Blue à 1 %. La longueur et le rayon de chaque décidue ont été mesurés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, et le volume a été calculé à partir de ces mesures comme V = πr2l.
Coloration HE et immunomarquage des sites d’implantation
Pour examiner le potentiel de développement des embryons auto-assemblés, nous avons collecté des décidues à divers stades, notamment 48, 72 et 84 h après la transplantation. Ces échantillons d’embryons reconstruits (ETX, EXE, et ETS) ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4% pendant une nuit à 4 °C, déshydratés avec des alcools à gradient, transférés dans du xylène et inclus dans de la paraffine. Nous avons utilisé des embryons de type sauvage E5.5, E6.0 et E6.5 comme contrôle. Les échantillons ont été tranchés à 5 μm d’épaisseur, colorés à l’hématoxyline et à l’éosine, et observés au microscope. Les échantillons déparaffinés et réhydratés ont été soumis à une récupération d’épitope induite par la chaleur dans un tampon citrate à environ 95 °C par un four à micro-ondes pendant 10 min, puis refroidis à température ambiante et rincés deux fois dans du PBS avec 3 min par deux fois. La perméabilisation a été effectuée avec 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 20 min à température ambiante. Après la perméabilisation, les échantillons ont été lavés dans du PBS à trois reprises (3 min chacun). Puis les échantillons ont été bloqués pendant 30 min avec de l’albumine de sérum bovin (BSA) à 5 % dans du PBS et incubés avec des anticorps primaires contre anti-CK de lapin (ab9377, Abcam), anti-COX2 de lapin (ab15191, Abcam), anti-Laminine de lapin (L9393, Sigma), anti-Gata4 de chèvre (sc-1237, Santa Cruz) ou anti-PL1 de souris (sc-376436, Santa Cruz) à 4 °C pendant la nuit. Le jour suivant, les tranches ont été lavées trois fois dans du PBS pendant 5 min et incubées avec l’anticorps secondaire pendant 30 min à 37 °C. Les anticorps secondaires ont été marqués avec le Fluorophore Alexa 488 ou 594 (Invitrogen). Ensuite, les coupes ont été rincées six fois dans du PBS pendant 5 minutes chacune et montées avec le milieu de montage Fluoroshield avec DAPI (ab104140, Abcam). Les lames ont été conservées à -20 °C jusqu’à leur observation. Les images ont été capturées avec un microscope à fluorescence Leica.
Hybridation in situ
L’hybridation in situ avec la digoxygénine (DIG) a été réalisée sur des cryosections52. Des sondes d’ARNc spécifiques à la souris pour la Dtprp ont été utilisées pour l’hybridation. Les sections hybridées avec des sondes sensées ont servi de contrôles négatifs. Les sections congelées (8-10 μm) ont été collées sur des lames recouvertes de poly-l-lysine (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, Chine) et stockées à -80 °C jusqu’à leur utilisation. Les sections ont été placées sur un réchauffeur de lames (37 °C) pendant 2 min, puis réhydratées dans du PBS, post-fixées dans du PFA à 4 % pendant 15 min à 4 °C, traitées à la protéinase K (15 μg par mL pendant 5 min à température ambiante), acétylées à 0,25 % pendant 10 min et hybridées avec des sondes marquées au DIG pendant une nuit à 65 °C. Deux lavages post-hybridation à 65 °C ont été effectués, suivis de deux lavages dans 1 × MABT, et d’un traitement à la RNase de 30 min (20 μg par mL) à 37 °C. Les sections ont été bloquées pendant 1 h, puis incubées pendant la nuit en bloc avec l’anticorps anti-DIG (1:2500, Sigma-Aldrich). Après lavage, la couleur a été développée en utilisant NBT/BCIP jusqu’à ce qu’un précipité brun soit visible. Les lames ont été contre-colorées avec du rouge rapide nucléaire, déshydratées et nettoyées au xylène, puis montées dans du milieu de montage cytoseal. Les photographies ont été prises rapidement avant que le précipité INT/BCIP ne s’estompe.
Identification du génotype des embryons auto-assemblés transférés
L’ADN génomique a été extrait des CSE DsRed, des CTS EGFP et des embryons ETX isolés des tissus de la caduque à l’aide d’un kit ADN TIANamp Micro (DP316, Tiangen) conformément aux instructions du fabricant. Le jeu d’amorces de diagnostic EGFP (5ʹ-AGGACGTCATCAAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATAGTCTTCTTCTG-3ʹ) et DsRed (5ʹ-GTGCTTCAGCCGCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCACCTTGATGCCGTTCT-3ʹ) ont été utilisés pour identifier la région des cellules et des échantillons par PCR. Le profil thermique était de 95 °C pendant 5 min, 35 cycles de 95 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 20 ou 40 s, et un cycle final à 72 °C pendant 5 min.
Statistiques
Les analyses statistiques ont été traitées sur le logiciel GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA) pour Windows (y compris les données d’expression Log2 des cellules uniques). La distribution normale et l’égalité des variances des données ont été vérifiées à l’aide du test F avant l’exécution de chaque test statistique paramétrique. Le cas échéant, des tests t de Student bilatéraux ont été effectués avec la correction de Welch si la variance entre les groupes n’était pas égale. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la s.e.m. ou s.d. comme spécifié. Les légendes des figures indiquent le nombre d’expériences indépendantes réalisées dans chaque analyse. Chaque expérience avait été répétée pour la reproductibilité.
Le volume des tissus (figures 1i et 7c, et figure supplémentaire 4h), le pourcentage et le calcul du nombre (figures 2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m et 7n ; figures supplémentaires 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a et 12g) ont été déterminés en utilisant Excel. L’analyse de la signification a été effectuée à l’aide du test t par GraphPad Prism. Les graphiques à barres ont été dessinés par Excel et GraphPad Prism, et les diagrammes de dispersion ont été tracés à l’aide de GraphPad Prism.
Résumé du rapport
Des informations supplémentaires sur la conception expérimentale sont disponibles dans le résumé du rapport de Nature Research lié à cet article.