Mice

Az összes állati eljárást és az összes egérrel végzett munkát a Kínai Mezőgazdasági Egyetem Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá (engedélyszám: SKLAB-2016-01-04). A CD1 és 129 egereket a Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.-től szereztük be. Az Actin-GFP egereket a Tongji Egyetem Shaorong Gao laboratóriumából szereztük be. Minden egeret specifikus kórokozómentes (SPF) körülmények között tartottunk, 12 órás sötét / 12 órás világos ciklussal 06:00 és 18:00 között, hőmérséklet-szabályozott szobában (22 ± 2 °C), szabad víz- és táplálékhoz való hozzáféréssel.

Sztem sejtvonalak és sejtkultúra

G4 és G4-ACTB-DsRed-MST ESC-ket Dr. Nagy András, Kristina Vintersten és Marina Gertsenstein laboratóriumából szereztük be a Mount Sinai Kórház & Samuel Lunemfeld Kutatóintézetből. A Blimp1-mVenus és Stella-ECFP (BVSC) kettős transzgénikus ESC-vonalat, amely a Prdm1 (Blimp1) szabályozó elemek kontrollja alatt membrán-célzott Vénuszt (mVenus) és a Dppa3 (Stella/Pgc7) kontrollja alatt fokozott CFP-t (ECFP) expresszál, Dr. Mitinori Saitou45,46-tól kaptuk.

A Lefty1-mCherry egér XEN sejtvonal létrehozásához a Lefty1 promótert és a fluoreszcens fehérjét a Sleeping Beauty transzpozon rendszerrel integráltuk XEN sejtekbe, amely két komponensből áll: a pT2/LTR7-GFP-ből módosított transzpozon vektor (addgene#62541) és a transzpozáz vektor (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879). A PT2/LTR7-GFP-t “puro” várral egészítettük ki, amely képes volt puromicin N-acetiltranszferázt expresszálni, és a GFP CDS régióját mCherry-vel helyettesítettük. A pT2/LTR7-GFP-ből a PT2-F (GTTTGGACACAAACCACAACACTAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACATCATCATTTTTTCTG) primerrel amplifikált DNS-fragmentumot a “puro” várral és az mCherry CDS régióval összekapcsolva a PT2-Puro-mCherry nevű vektort a NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs) segítségével nyertük meg. A Lefty1 gén promóterszekvenciáját egér ES sejtek DNS-éből amplifikáltuk Lefty1-F (GTCCGGTGGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTTGAGTCTGCGG) használatával. Ezután a Lefty1 gén promóterszekvenciáját NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs) segítségével adtuk hozzá a PT2-Puro-mCherry-hez, amelyben a PT2-Puro-mCherry-t EcoRI-vel linearizáltuk, majd a Lefty1 gén promóterszekvenciájához hozzáadtuk az EcoRI szekvenciát tartalmazó átfedő szekvenciát. A vektor a PT2-Puro-mCherry-Lefty1 nevet kapta. Ezután a PT2-Puro-mCherry-Lefty1-et és a pCMV(CAT)T7-SB100-at egér XEN sejtekbe transzfektáltuk, és 2 μg/ml puromicinnel szűrtük a későbbi elemzésekhez.

A Lamc1 (laminin, gamma 1) knockout sejtvonalak előállításához két, a Lamc1 exon1-jét célzó (GGAGTACTGCGTGCAGCAGACTGGGG és GCTTTGCCACCAGGTGGTGGTGTCGG) sgRNS szekvenciát használtunk egy kettős sgRNS vektor létrehozásához. A két sgRNS-szekvenciát tartalmazó fragmentumokat a PUC-U6-sgRNS-Kana (Huang Xingxu laborjából) amplifikáltuk primerek segítségével (Lamc1sg1-F: atgcgtctcacaccggagtactgcgtgcagactggttttagttagctagaaatagcaag és Lamc1sg2-R: atgcgtctcgaaacacaccacctggtggcaaagcggtgtttcgtcctttttccacaag). A PCR-terméket BsmbI-vel emésztettük és ligáltuk a linearizált PX330-GFP-vel. A vektorokat Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific) segítségével transzfektáltuk ESC-kbe és XENC-kbe. Ezután a GFP-pozitív sejteket áramlási citometriával válogattuk és hígítottuk a monoklonális növekedéshez. A kapott monoklonális sejtekből DNS-t extraháltunk, majd PCR-amplifikációnak és szekvenálásnak vetettük alá. A knockout-pozitív sejteket szelektáltuk a további kísérletekhez.

A Nodal knockout sejtvonalak előállításához a Nodal 1. exonját célzó (GCCCTCGTCACCCGTCCCCCCTCTGG) gRNS szekvenciát használtuk az sgRNS vektor konstruálásához. A Nodal sgRNS primereit (Nodal-sgF: caccgccctcgtcgtcaccgtcccctc és Nodal-sgR: aaacgaggggacggtgacgagggc) lágyítottuk, és a lágyított terméket BbsI-vel ligáltuk a linearizált PX330-GFP-hez. A vektorokat Lipofectamine 3000 segítségével ESC-kbe transzfektáltuk, majd a GFP-pozitív sejteket áramlási citometriával válogattuk és hígítottuk a monoklonális növekedéshez. A kapott monoklonális sejtekből DNS-t extraháltunk, majd PCR-amplifikációnak és szekvenálásnak vetettük alá. A knockout-pozitív sejteket szelektáltuk a további kísérletekhez.

A p53 knockout ESC vonal létrehozásához a p53 mutációhoz szükséges sgRNS szekvenciát klónoztuk a PX330-GFP vektorba (addgene, #48138) CRISPR-Cas9 rendszer59 segítségével. A vektort Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific) segítségével transzfektáltuk a G4 ESC-kbe. Három nappal a transzfekció után a GFP-pozitív sejteket kiválogattuk és 6 lyukú lemezre ültettük. A kolóniákat kiszedtük, és a knockout régiókat PCR segítségével primerek (F: CATCCAGGCGGGAAATAGAGAC; R: CCTGACTGTGTGTGTAAACTAGGC) segítségével felszaporítottuk és szekvenáltuk. A vad típusú szekvenciával való összehangolással homozigóta knockout sejtkolóniákat azonosítottunk és választottuk ki a további vizsgálatokhoz.

Az ES sejteket Dulbecco’s Modified Eagle Mediumban (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) tenyésztettük, 15% (v/v) FBS (Gibco, ES sejt minősített), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-merkaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM nem esszenciális aminosavak (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM nátrium-piruvát (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin-streptomicin (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1000 IU LIF (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM PD0325901 (4423, Tocris) és 3 µM CHIR99021 (4192, Tocris). Az ESC-ket 37 °C-on és 5% CO2-on tenyésztettük zselatinizált és feederrel borított szövettenyésztési minőségű lyuklemezeken, és 80%-os konfluencia elérésekor passziváltuk őket.

Az ESC-ket 5 hetes nőstény CD1 egér méhéből kiöblített E3.5 blasztocisztákból nyertük15,60. A blasztocisztákat mitotikusan inaktivált egér MEF sejteken (feeder sejtek) tenyésztettük TSC táptalajjal: fejlett RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific), kiegészítve 20% (v/v) FBS-szel (Gibco, ES sejt minősített), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-merkaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM nátrium-piruvát (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% (v/v) penicillin-streptomicin (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng/ml rekombináns humán FGF4 (235-F4-025, R&D) és 1 µg/ml heparin (07980, Stem Cell). Amíg a kinövések a 4. napon nem alakultak ki, ezt követően az inkubátorban 5 percig 0,1%-os tripszin-EDTA-ban történő inkubálással szétbontottuk őket. Adjunk hozzá friss egér 70%-os embrionális fibroblaszt-kondicionált médiumot, amely FGF4-et és heparint tartalmaz, hogy leállítsuk a reakciót, és visszatesszük az inkubátorba. A táptalajt minden második napon cserélje ki, amíg TS sejtkolóniák nem figyelhetők meg, és a sejtek fenntartásához cserélje a táptalajt TSC táptalajra. Az EGFP-t expresszáló TSC (TSC-EGFP) sejtvonalakat vad típusú TSC-kből nyertük, amelyeket JetPrime (114-15, Polyplus transfection) segítségével transzfektáltunk a PB-UBC-EGFP vektorral. A TSC-ket 37°C-on és 5% CO2 mellett tenyésztettük zselatinizált és feederrel borított szövettenyésztési minőségű lyuklemezen, és 80%-os konfluencia elérése után passziváltuk őket. A táptalajt naponta cseréltük.

XENC-ket 5 hetes nőstény 129-es egér méhéből kiöblített E3.5 blasztocisztákból származtattunk módosított XENC körülmények között61. Az egér-blasztocisztákat feeder sejteken tenyésztettük, amíg a 4. napon kinövést nem képeztek, amelyet ezt követően 0,1%-os tripszin-EDTA-ban inkubálva 5 percig az inkubátorban szétbontottunk. A PD0325901 és CHIR99021 nélküli friss egér ES-sejt médiumot adjunk a reakció leállításához, és minden második napon cseréljük le a médiumot, amíg XEN sejtkolóniák nem figyelhetők meg. A XEN sejtkolóniákat standard XEN médiummal tartottuk fenn: fejlett RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific), kiegészítve 15% (v/v) FBS-szel (Gibco) és 0,1 mM β-merkaptoetanollal (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin-streptomicinnel (15140122, Thermo Fisher Scientific). A XENC-EGFP sejtvonal közvetlenül Actin-EGFP egér blasztocisztából származott. A feedermentes tenyésztéshez a XENC-eket zselatinnal bevont, szövetkultúra minőségű lyuklemezen tartottuk. A XENC sejteket 37 °C-on és 5% CO2 mellett tenyésztettük. A sejteket 90%-os konfluencia elérése után passzíroztuk. A táptalajt naponta cseréltük.

Az önszerveződő embriók generálása

A 80%-os konfluenciát elérő XENC sejteket egyszer mostuk PBS-szel (14190-094, Gibco), majd 5 percig 37 °C-on TrypLE-ben (12605010, Thermo Fisher Scientific) inkubáltuk. A TSC-ket és XENC-ket 0,1%-os tripszin-EDTA-val (25300054, Thermo Fisher Scientific) 37 °C-on történő inkubálással egyes sejtekké disszociáltuk. A sejteket 5 percig 1000 rpm-en történő centrifugálással pelletáltuk. A pelletet újra szuszpendáltuk a rekonstruált embrió médiumban, egyes sejtekké pipettázva. A sejteket automatizált sejtszámlálóval automatikusan megszámoltuk.

ETX-embrioidok esetében keverjük össze az ESC-ket, TSC-ket és XNEC-ket 1 × 105, 1 × 105, illetve 2 × 105 sejtszámmal (ETS-embrioidok esetében keverjük össze az ESC-ket és TSC-ket 1 × 105, illetve 1 × 105 sejtszámmal; EXE-embriók esetében keverjük össze az ESC-ket és a XENC-ket 1 × 105, illetve 1 × 105 sejtszámban) 2 ml rekonstruált embrióközeggel 35 mm-es kezeletlen sejttenyésztő tányéronként. Mozgassa a tálat a vízszintes rotátorokon 37 °C, 5% CO2 és 100% páratartalom mellett. A forgási sebesség 60 rpm/perc. A rekonstruált embrió táptalaj 39% fejlett RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) és 39% DMEM (11960069, Thermo Fisher Scientific) kiegészítést tartalmaz 17,5% FBS (Gibco, ES sejt minősített), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-merkaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM MEM nem esszenciális aminosavak (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM nátrium-piruvát (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin-streptomicin (15140122, Thermo Fisher Scientific). A táptalajt naponta 2 mL friss rekonstruált embrió táptalajjal cseréltük.

AzEXE-embriók következetesen és hatékonyan képződtek, a funkcionális kísérletek szabályos vagy szabálytalan struktúrák kiválasztása nélkül végezhetők. Az ETX-embrioidok és ETS-embrioidok funkcionális kísérleteihez a szabályos struktúrákat morfológiájuk alapján választottuk ki, az ESC és TSC kompartmentek megfelelő arányait és pozícióit pedig a TSC-EGFP jelzése alapján sztereó fluoreszcens mikroszkóp alatt.

Wild típusú embriók kinyerése és in vitro tenyésztése

A blasztocisztákat E4,5 szuperovulált vemhes nőstény egerekből nyertük ki M2-vel (MR-015-D, Millipore) történő méhöblítéssel. Az embriók tenyésztése IVC táptalajban a mural trophectoderma eltávolítása után in vitro 8 lyukú μ-Slides-on (80826, Ibidi)62. Az E5,5, E5,75 és E6,5 embriók kinyeréséhez a decidua eltávolítása a méhből a leírt protokoll szerint63. A CD1 egerekből származó EPI-embriókat az E5,0 napon boncoltuk fel, ahogyan arról korábban beszámoltunk28 , és ETX-embrioid médiummal in vitro tenyésztettük.

Immunofluoreszcens festés

Az egérembriókat és a rekonstruált embriókat 4%-os paraformaldehiddel (DingGuo, AR-0211) fixáltuk 4 °C-on 20 percig, majd háromszor mostuk mosópufferrel (0,1% Tween-20-t tartalmazó PBS). Ezután az embriókat 0,5%-os Triton X-100-zal (H5142, Promega) permeabilizáltuk 30 percig szobahőmérsékleten, majd 4 °C-on egy éjszakán át blokkoló pufferben (3% BSA, 0,3% Triton X-100) primer antitestekkel inkubáltuk. A nem kötött primer antitestek eltávolítása érdekében végzett mosás után a sejteket blokkoló pufferben lévő másodlagos antitesttel inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on. A sejtmagokat DAPI-val festettük meg, majd kétszer mostuk át mosópufferrel, majd DAPI-t tartalmazó Fluoroshield Mounting Mediumban (104140, abcam) montíroztuk. A képeket Nikon A1 konfokális mikroszkóppal készítettük.

Képalkotás feldolgozással és elemzéssel

Az egérembriók és a rekonstruált embriók képeit Nikon A1 konfokális mikroszkóppal készítettük 20 × vagy 40 × objektívvel. Minden elemzést a ”Fiji” nyílt forráskódú képelemző szoftverrel végeztünk. A rekonstruált embriók és a vad típusú embriók szöveti térfogatát és sejtszámát megbecsültük, és a PCX-eloszlás elemzéséhez szükséges immunfluoreszcencia-intenzitás méréseket szintén a Fiji szoftver9 segítségével végeztük el.

Nagy áteresztőképességű egysejtes qPCR és adatfeldolgozás

Az egysejtes izoláláshoz egyes sejteket különböző fejlődési stádiumokban (0, 24 és 84 h) gyűjtöttünk kétféle ETX-embrióból, amelyeket Lefty1-mCherry XENC (LC-ETX-embriók), illetve BVSC ESC (BVSC-ETX-embriók) riporter sejtvonalakkal rekonstruáltunk. Az egyes sejtek izolálásához csak az mCherry-fehérjék aszimmetrikus expressziójával azonosított DVE/AVE-szerű szövetekkel rendelkező LC-ETX-embrioidokat, és az ESC-kompartmentben az ESC- és TSC-kompartmentek határának közelében lévő mVenus-fehérjék aszimmetrikus expressziójával rendelkező BVSC-ETX-embrioidokat szelektáltuk. Az LC-ETX-embrioidok esetében 0, 24 és 84 h LC-negatív ESC-eredetű sejteket (LC- XEN), valamint 84 h pozitív ESC-ket (BVSC+ ES) gyűjtöttünk az LC- XEN ellentétes oldaláról. A BVSC-ETX-embrioidok esetében 0, 24 és 84 h BV negatív ESC-eredetű sejteket (BVSC- ES), valamint 84 h pozitív ESC-ket (BVSC+ ES) gyűjtöttünk a BVSC- ES ellentétes oldaláról. Ezenkívül a BVSC-ESC-kkel 0, 24 és 84 h-kor összeszerelt ETX-embrioidokban lévő TSC-kompartmentekből származó egysejteket is összegyűjtöttük az EGFP riporter alapján.

Az egysejtes elkülönítéshez minden ETX-embrioidot 0,1%-os tripszin-EDTA-ban (Invitrogen, Carlsbad, USA) inkubáltunk 5 percig 37 °C-on, majd M2 médiumba (MR-015-D, Millipore) helyeztük át. Többszöri kíméletes, ismételt szájjal történő pipettázás után finomra húzott üveghegy segítségével izoláltuk az egyes sejteket. Átlagosan 30-40 sejtet gyűjtöttünk típusonként. Minden sejtet háromszor mostunk Dulbecco foszfáttal pufferelt sóoldatban (Invitrogen, Carlsbad, USA), amely 0,1% BSA-t (Sigma-Aldrich, MO, USA) tartalmazott, és reverz transzkripciós-polimeráz láncreakció (RT-PCR) mesterkeverékbe helyeztük a lízishez, szekvencia-specifikus reverz transzkripcióhoz és előamplikációhoz, a korábbi jelentésben leírtak szerint64.

A primerek tervezéséhez és validálásához olyan géneket választottunk, amelyek a sejtvonal-differenciálódást szabályozzák (főként az E3,5 és E6,5 stádium között) és domináns jelátviteli útvonalban vesznek részt (Pl, Wnt, Nodal jelátviteli útvonal) az egér embriogenezisének megfelelően választottuk ki. Az egyes érdekelt gének mRNS-szekvenciáit az NCBI-ból kerestük le, és a különböző transzkripttel rendelkező gének esetében csak a közös régiókat használtuk. A génspecifikus qRT-primereket a Primer3 szoftverrel terveztük 100-250 bp hosszúságban. Minden primert egérembriók cDNS-ével (E5,5 és E6,5 keveréke) teszteltünk az amplifikáció hatékonysága és specificitása szempontjából (az 1. kiegészítő adatokban szerepel).

Egysejtes szekvencia-specifikus előamplifikáció a korábbi jelentéshez hasonlóan65. Összesen 96 primer-készletet egyesítettünk 0,1 μM végső koncentrációra minden egyes primer esetében. Az embriókból izolált egyedi sejteket steril mikrocsövekbe helyeztük át, amelyekbe 5 μL RT-PCR master mixet töltöttünk, amely 2,5 μL CellsDirect reakciómixet (Invitrogen, Carlsbad, USA), 0,5 μL primer pool-t, 0,1 μL RT/Taq enzimet (Invitrogen, Carlsbad, USA) és 1,9 μL nukleázmentes vizet (Invitrogen, Carlsbad, USA) tartalmazott minden egyes csőben. A csöveket azonnal lefagyasztottuk szárazjégen. Rövid, 4 °C-on végzett centrifugálás után a csöveket azonnal PCR-gépbe helyeztük. A sejtlízist és a szekvencia-specifikus reverz transzkripciót 50 °C-on végeztük 1 órán keresztül. Ezt követően a reverz transzkriptáz inaktiválása és a Taq-polimeráz aktiválása 95 °C-ra történő 3 perces melegítéssel történt. Ezt követően ugyanabban a csőben a cDNS 20 ciklusos szekvencia-specifikus amplifikáción ment keresztül, 15 másodpercig 95 °C-on történő denaturálással, majd 15 percig 60 °C-on történő lágyítással és elongációval. A párolgás elkerülése érdekében a kapott termékeket -80 °C-on tároltuk.

A nagy áteresztőképességű mikrofluidikus egysejtes kvantitatív PCR-hez az összes előamplifikált cDNS-terméket valós idejű PCR-rendszerrel (ABI 7500) validáltuk az endogén kontroll gén Actinb segítségével, és csak a 9-12 küszöbérték közötti küszöbértéket (Ct) választottuk ki a további kísérlethez. Az amplifikált egysejtű mintákat SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX (Bio-Rad, Kalifornia, USA) és egyedi qPCR-primerek segítségével elemeztük 96 × 96 dinamikus tömbben a Biomark System (Fluidigm, San Francisco, USA) rendszerben. A Ct-értékek kiszámítását a BioMark Real-Time PCR Analysis szoftverrel (Fluidigm, San Francisco, USA) végeztük.

Az egysejtes adatok feldolgozásához és vizualizálásához a BioMark rendszerből kapott összes nyers Ct-értéket Log2 relatív expressziós szintre alakítottuk át úgy, hogy az értékeket kivontuk a 26-os feltételezett háttér Ct-értékből. Az endogén kontrollgének (Actinb és Gapdh) alacsony vagy hiányzó expresszióját mutató mintákat kizártuk a későbbi elemzésből. Az expressziós adatokra PLS-DA-t alkalmaztunk a különböző ETX-embrioidok sejtcsoportjainak megkülönböztetésére a mixOmics66 R-csomag segítségével. Hierarchikus klaszterezést végeztünk az euklideszi távolságok segítségével, és a dendrogramokat a fluidigmSC csomag segítségével jelenítettük meg a soronkénti hőtérképek mentén. Box-plotokat és violin plotokat az origin 8.6 és az R szoftverrel készítettünk.

BVSC ESC-chimerikus embriók előállítása

A BVSC ESC-chimerikus embriókat 8-sejtes embrióinjekciós módszerrel, Piezo mikromanipulációval67 állítottuk elő. Annak érdekében, hogy biztosítsuk, hogy a gazdasejt embriókat a tömörítés előtt injektáltuk, az embriókat a kétsejtes stádiumban gyűjtöttük be és tenyésztettük in vitro. A kétsejtes stádiumú embriók kinyeréséhez 5 hetes nőstény egereket szuperovuláltunk 5 nemzetközi egység (IU) PMSG intraperitoneális injekciójával, majd 46-48 órával később 5 IU HCG-vel, és hím egerekkel párosítottuk őket. A kétsejtes stádiumú embriókat a petevezeték M2-vel történő átöblítésével gyűjtöttük E1,5-nél. Az embriókat M2-ben (MR-015-D, Millipore) mostuk, majd 10 μL KSOM (MR-020P-5F, Millipore) cseppekbe helyeztük át ásványi olajjal borított szövettenyésztő tálra. Az embriókat 37 °C-on, 5% CO2 mellett tartottuk inkubátorban.

A 8 sejtes stádiumú embriókba Piezo mikromanipulációval67,68 kb. 15 ES-sejtet injektáltunk. A nyolchetes CD1 nőstényeket vazektomizált hímekkel párosítva álvemhes egerekként használtuk. Az injektált blasztocisztákat 2,5 nappal a coitum után (dpc) ültették át az álvemhes nőstények méhébe. A morula stádiumban lévő embriókat injektált ESC-kkel együtt 0,5 dpc-es recipiensek petevezetékébe ültettük át. Recepciónként 14-16 embriót ültettünk át. E6,5-nél a fent leírtak szerint gyűjtöttük a kiméra embriókat a deciduumokból.

Embriótranszfer és beültetés értékelése

A vazektomizált hímekkel párosított nyolchetes CD1 nőstényeket használtuk álvemhes egerekként. A rekonstruált embriók esetében 36 h rekonstruált gömböket (ETX-, ETS- és EXE-embriók) ültettünk át 2,5 dpc vagy 3,5 dpc időpontban álvemhes fogadó CD1 nőstény egerek méhszarvába. Recepciónként tizenhat-húsz embriót ültettek át. A beültetési helyeket a 6,5. napon 100 μl 1%-os Chicago Sky Blue oldat intravénás injekciójával azonosítottuk és megszámoltuk. Minden egyes decidua hosszát és sugarát képelemző szoftverrel megmértük, és a térfogatot ezekből a mérésekből számoltuk ki, mint V = πr2l.

HE festés és a beültetési helyek immunfestése

Az önbeültetett embriók fejlődési potenciáljának vizsgálatához különböző stádiumokban gyűjtöttünk deciduát, beleértve a transzplantációt követő 48, 72 és 84 órát. Ezeket a rekonstruált (ETX, EXE és ETS) embrió mintákat 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk egy éjszakán át 4 °C-on, majd gradiens alkoholokkal dehidratáltuk, xilolba vittük és paraffinba ágyaztuk. Kontrollként E5,5, E6,0 és E6,5 vad típusú embriókat használtunk. A mintákat 5 μm vastagságúra szeleteltük, hematoxilinnal és eozinnal festettük, és mikroszkóp alatt megfigyeltük. A deparaffinált rehidratált mintákat 10 percig mikrohullámú sütőben kb. 95 °C-on citrát pufferben hőindukált epitóp-visszanyerésnek vetettük alá, majd ezt követően szobahőmérsékletre hűtöttük, és kétszer 3 perc alatt kétszer 3 percig PBS-ben öblítettük. A permeabilizálást 0,5%-os Triton X-100-mal végeztük PBS-ben 20 percig szobahőmérsékleten. A permeabilizálás után a mintákat háromszor (egyenként 3 percig) PBS-ben mostuk. Ezután a mintákat 30 percig 5% szarvasmarha szérumalbuminnal (BSA) PBS-ben blokkoltuk, majd a nyúl anti-CK (ab9377, Abcam), nyúl anti-COX2 (ab15191, Abcam), nyúl anti-Laminin (L9393, Sigma), kecske anti-Gata4 (sc-1237, Santa Cruz) vagy egér anti-PL1 (sc-376436, Santa Cruz) elleni primer antitestekkel inkubáltuk 4 °C-on egy éjszakán át. Másnap a szeleteket háromszor 5 percig mostuk PBS-ben, majd 30 percig 37 °C-on inkubáltuk a másodlagos antitesttel. A másodlagos antitesteket Alexa fluorofór 488 vagy 594 (Invitrogen) fluorofórral jelöltük. Ezt követően a metszeteket hatszor öblítettük PBS-ben, egyenként 5 percig, majd DAPI-t tartalmazó Fluoroshield montírozóközeggel (ab104140, Abcam) montíroztuk. A tárgylemezeket a megfigyelésig -20 °C-on tartottuk. A képeket Leica fluoreszcens mikroszkóppal készítettük.

In situ hibridizáció

In situ hibridizációt végeztünk digoxigeninnel (DIG) a krioszekciókon52. A hibridizációhoz egérspecifikus cRNS-szondákat használtunk a Dtprp számára. A sense szondákkal hibridizált metszetek negatív kontrollként szolgáltak. A fagyasztott metszeteket (8-10 μm) poli-l-lizin bevonatú tárgylemezekre (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, Kína) ragasztották, és felhasználásig -80 °C-on tárolták. A metszeteket 2 percre tárgylemezmelegítőre helyeztük (37 °C), majd PBS-ben rehidratáltuk, 4%-os PFA-ban 15 percig 4 °C-on posztfixáltuk, proteináz K-val kezeltük (15 μg/ml 5 percig szobahőmérsékleten), 10 percig 0,25%-ban acetileztük, és DIG-jelölt szondákkal hibridizáltuk egy éjszakán át 65 °C-on. Két 65 °C-os poszthibridizációs mosást végeztünk, amelyet két mosás követett 1 × MABT-ben, majd 30 perces RNáz-kezelés (20 μg per mL) 37 °C-on. A metszeteket 1 órán át blokkoltuk, majd egy éjszakán át blokkban anti-DIG antitesttel (1:2500, Sigma-Aldrich) inkubáltuk. Mosás után a színt NBT/BCIP segítségével fejlesztettük, amíg barna csapadék nem vált láthatóvá. A tárgylemezeket nukleáris gyors vörössel ellenfestettük, dehidratáltuk és xilolban tisztítottuk, majd citózus rögzítő közegbe montíroztuk. A fényképeket azonnal elkészítettük, mielőtt az INT/BCIP csapadék elhalványulása bekövetkezne.

A transzferált önösszeszedett embriók genotípus-azonosítása

A genomi DNS-t a decidua szövetekből izolált DsRed-ESC-kből, EGFP-TSC-kből és ETX-embriókból a TIANamp Micro DNA Kit (DP316, Tiangen) segítségével, a gyártó utasításainak megfelelően vontuk ki. A diagnosztikai primer készlet EGFP (5ʹ-AGGACGTCATCAAGGAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATAGTCTTCTTCTTCTTCTG-3ʹ) és DsRed (5ʹ-GTGCTTCAGCCGCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCACCTTGATGCCCCGTTCT-3ʹ) a sejtek és a minták régiójának PCR általi azonosítására használtuk. A hőprofil a következő volt: 95 °C 5 percig, 35 ciklus: 95 °C 30 másodpercig, 60 °C 30 másodpercig és 72 °C 20 vagy 40 másodpercig, majd egy utolsó ciklus 72 °C-on 5 percig.

Statisztika

A statisztikai elemzések feldolgozása GraphPad Prism 7.0 szoftverrel (GraphPad Software, La Jolla, CA) történt Windows alatt (beleértve az egysejtes Log2 expressziós adatokat). Az adatokat az egyes parametrikus statisztikai tesztek elvégzése előtt F-próbával ellenőriztük a normális eloszlás és a varianciaegyenlőség szempontjából. Adott esetben kétfarkú Student’s t-teszteket végeztünk Welch-korrekcióval, ha a csoportok közötti variancia nem volt egyenlő. A hibasávok az s.e.m. vagy s.d. standard hibáját jelentik a megadottak szerint. Az ábrák legendái jelzik az egyes elemzésekben elvégzett független kísérletek számát. A reprodukálhatóság érdekében minden kísérletet megismételtünk.

A szövetek térfogatát (1i. és 7c. ábra, valamint a 4h. kiegészítő ábra), százalékos és számszerű számítását (2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m és 7n ábrák; 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a és 12g kiegészítő ábrák) Excel segítségével határoztuk meg. A szignifikanciaelemzést t-próbával végeztük a GraphPad Prism segítségével. Az oszlopdiagramokat az Excel és a GraphPad Prism segítségével, a szórásdiagramokat pedig a GraphPad Prism segítségével ábrázoltuk.

Beszámolói összefoglaló

A kísérleti tervezéssel kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.

További információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.