Ratones

Todos los procedimientos con animales y todo el trabajo con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Agricultura de China (Número de permiso: SKLAB-2016-01-04). Los ratones CD1 y 129 se obtuvieron de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Los ratones Actin-GFP se obtuvieron del laboratorio de Shaorong Gao en la Universidad de Tongji. Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) con un ciclo de 12 h de oscuridad / 12 h de luz entre las 06:00 y las 18:00 en una sala de temperatura controlada (22 ± 2 °C) con libre acceso a agua y comida.

Líneas de células madre y cultivo celular

Las ESC G4 y G4-ACTB-DsRed-MST se obtuvieron del laboratorio del Dr. Andras Nagy, Kristina Vintersten y Marina Gertsenstein en el Hospital Mount Sinai &el Instituto de Investigación Samuel Lunemfeld. La línea ESC doblemente transgénica Blimp1-mVenus y Stella-ECFP (BVSC), que expresa Venus dirigido a la membrana (mVenus) bajo el control de elementos reguladores Prdm1 (Blimp1) y CFP mejorada (ECFP) bajo el control de Dppa3 (Stella/Pgc7), se obtuvo del Dr. Mitinori Saitou45,46.

Para la generación de la línea celular XEN de ratón Lefty1-mCherry, se utilizó el promotor Lefty1 y la proteína fluorescente para integrarlos en las células XEN mediante el sistema de transposones Sleeping Beauty, que consta de dos componentes: el vector de transposones modificado de pT2/LTR7-GFP (addgene#62541) y el vector de transposasas (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879). A PT2/LTR7-GFP se le añadió el castillo «puro», que podía expresar puromicina N-acetiltransferasa, y la región CDS de GFP se sustituyó por mCherry. El fragmento de ADN, que se amplificó a partir de pT2/LTR7-GFP mediante el cebador PT2-F (GTTTGGACAAACCACAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACATCATTTTCTG), se acopló con el castillo «puro» y la región CDS de mCherry para adquirir el vector denominado PT2-Puro-mCherry utilizando la mezcla maestra de montaje de ADN NEBuilder®HiFi (NEW ENGLAND BioLabs). La secuencia promotora del gen Lefty1 se amplificó a partir del ADN de células ES de ratón utilizando Lefty1-F (GTCCGGTGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTTGAGTCTGCGG). A continuación, la secuencia promotora del gen Lefty1 se añadió a PT2-Puro-mCherry mediante NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs), en el que PT2-Puro-mCherry se linealizó mediante EcoRI y la secuencia de solapamiento que contiene la secuencia EcoRI se añadió a la secuencia promotora del gen Lefty1. El vector se denominó PT2-Puro-mCherry-Lefty1. A continuación, PT2-Puro-mCherry-Lefty1 y pCMV(CAT)T7-SB100 se transfectaron en células XEN de ratón y se examinaron mediante 2 μg por mL de puromicina para los análisis posteriores.

Para la generación de líneas celulares knockout de Lamc1 (laminina, gamma 1), se utilizaron dos secuencias de sgRNA dirigidas (GGAGTACTGCGTGCAGGGGG y GCTTTGCCACGGTGTCGG) al exón1 de Lamc1 para construir un vector de sgRNA dual. Los fragmentos que contenían dos secuencias de sgRNA se amplificaron a partir de PUC-U6-sgRNA-Kana (del laboratorio de Huang Xingxu) utilizando cebadores (Lamc1sg1-F: atgcgtctcaccggagtactgcgtgcagactggttttagagctagaaatagcaag y Lamc1sg2-R: atgcgtctcgaaacaccacctggtggcaaagcggtcgtcctttccacaag). El producto de la PCR fue digerido con BsmbI y ligado con PX330-GFP linealizado. Los vectores se transfectaron en ESCs y XENCs utilizando Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific), respectivamente. A continuación, las células positivas a la GFP se clasificaron mediante citometría de flujo y se diluyeron para el crecimiento monoclonal. El ADN se extrajo de las células monoclonales obtenidas y se sometió a amplificación y secuenciación por PCR. Para la generación de líneas celulares Nodal knockout, se utilizó la secuencia de ARNg dirigida al exón1 de Nodal (GCCCTCGTCACCGTCCCCTGG) para construir el vector de ARNg. Los cebadores para el sgRNA de Nodal (Nodal-sgF: caccgccctcgtcaccgtcccctc y Nodal-sgR: aaacgaggggacggtgacgagggc) fueron recocidos y el producto recocido fue ligado al PX330-GFP linealizado por BbsI. Los vectores se transfectaron en ESCs utilizando Lipofectamine 3000 y las células GFP-positivas se clasificaron mediante citometría de flujo y se diluyeron para su crecimiento monoclonal. Se extrajo el ADN de las células monoclonales obtenidas y se sometió a amplificación por PCR y secuenciación. Se seleccionaron las células knockout-positivas para los experimentos de seguimiento.

Para la generación de la línea ESC knockout de p53, la secuencia sgRNA para la mutación de p53 se clonó en el vector PX330-GFP (addgene, #48138) utilizando el sistema CRISPR-Cas959. El vector se transfectó en ESCs G4 mediante Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Tres días después de la transfección, las células positivas a la GFP se clasificaron y se colocaron en una placa de 6 pocillos. Se recogieron las colonias y se amplificaron las regiones knockout mediante PCR utilizando cebadores (F: CATCCAGGCGGAAATAGAGAC; R: CCTGACTGTGTTAAACTAGGC) y se secuenciaron. Mediante la alineación con la secuencia de tipo salvaje, se identificaron colonias de células knockout homocigóticas y se seleccionaron para su estudio posterior.

Las células ES se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) con 15% (v/v) de FBS (Gibco, calificado para células ES), 2 mM de GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM de β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM de aminoácidos no esenciales MEM (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM de piruvato de sodio (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% de penicilina-estreptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1000 UI de LIF (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM de PD0325901 (4423, Tocris) y 3 µM de CHIR99021 (4192, Tocris). Las ESC se cultivaron a 37 °C y 5% de CO2 en placas de pocillos gelatinizadas y cubiertas con alimentador, y se pasaron cuando se alcanzó el 80% de confluencia.

Las ESC se derivaron de blastocistos E3.5 extraídos del útero de ratones CD1 hembra de 5 semanas de edad15,60. Los blastocistos se cultivaron en células MEF de ratón inactivadas mitóticamente (células alimentadoras) con un medio de cultivo de TSC: RPMI 1640 avanzado (11875-093, Thermo Fisher Scientific) complementado con un 20% (v/v) de FBS (Gibco, calificado para células ES), 2 mM de GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 01 mM de β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM de piruvato sódico (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng por mL de FGF4 humano recombinante (235-F4-025, R&D) y 1 µg por mL de heparina (07980, Stem Cell). Hasta que se formaron los brotes el día 4, se desagregaron posteriormente incubándolos en tripsina-EDTA al 0,1% durante 5 min en la incubadora. Añadir medio fresco acondicionado con fibroblastos embrionarios de ratón al 70% que contenga FGF4 y heparina para detener la reacción y volver a la incubadora. Reemplace el medio cada dos días hasta que se puedan observar las colonias de células TS, y cambie el medio con el medio de cultivo TSC para mantener las células. Las líneas celulares de TSC que expresan EGFP (TSC-EGFP) se derivaron de TSC de tipo salvaje que se transfectaron con el vector PB-UBC-EGFP mediante JetPrime (114-15, Polyplus transfection). Las TSC se cultivaron a 37°C y 5% de CO2 en una placa de pocillos de grado de cultivo tisular gelatinizada y cubierta con un alimentador, y se pasaron cuando se alcanzó el 80% de confluencia. El medio de cultivo se cambió diariamente.

Los XENCs se derivaron de blastocitos E3.5 extraídos del útero de ratones hembra 129 de 5 semanas de edad utilizando condiciones XENC modificadas61. Los blastocistos de ratón se cultivaron en células alimentadoras hasta que formaron un brote en el día 4 que posteriormente se disgregó incubando en tripsina-EDTA al 0,1% durante 5 minutos en la incubadora. Se añadió medio fresco de células ES de ratón sin PD0325901 y CHIR99021 para detener la reacción, y se sustituyó el medio cada dos días hasta que se pudieron observar las colonias de células XEN. Las colonias de células XEN se mantuvieron con el medio estándar XEN: RPMI 1640 avanzado (11875-093, Thermo Fisher Scientific) complementado con 15% (v/v) de FBS (Gibco) y 0,1 mM de β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1% de penicilina-estreptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific). La línea celular XENC-EGFP se derivó directamente del blastocisto de ratón Actin-EGFP. Para el cultivo sin alimentador, las XENC se mantuvieron en una placa de pocillos de grado de cultivo tisular recubierta de gelatina. Las células XEN se cultivaron a 37 °C y 5% de CO2. Se pasaron una vez que alcanzaron el 90% de confluencia. El medio de cultivo se cambió diariamente.

Generación de embriones autoensamblados

Las TSCs, que alcanzaron el 80% de confluencia, se lavaron una vez con PBS (14190-094, Gibco) y se incubaron durante 5 min a 37 °C en TrypLE (12605010, Thermo Fisher Scientific). Las TSC y las XENC se disociaron en células individuales mediante la incubación con tripsina-EDTA al 0,1% (25300054, Thermo Fisher Scientific) a 37 °C. Las células se pelletearon por centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos. El pellet se resuspendió en medio de embrión reconstruido mediante pipeteo para obtener células individuales. Las células se contaron automáticamente con un contador celular automatizado.

Para los embriones ETX, se mezclan ESC, TSC y XNEC en un número de células de 1 × 105, 1 × 105 y 2 × 105, respectivamente (para los embriones ETS, se mezclan ESC y TSC en un número de células de 1 × 105 y 1 × 105, respectivamente; Para los embriones EXE, mezclar ESC y XENC en un número de células de 1 × 105 y 1 × 105, respectivamente) con 2 mL de medio de embrión reconstruido por placa de cultivo celular de 35 mm sin tratar. Mueva el plato en los rotadores horizontales a 37 °C, 5% de CO2 y 100% de humedad. La velocidad de rotación es de 60 rpm por minuto. El medio de embriones reconstruidos incluye un 39% de RPMI 1640 avanzado (11875-093, Thermo Fisher Scientific) y un 39% de DMEM (11960069, Thermo Fisher Scientific) suplementado con un 17,5% de FBS (Gibco, calificado para células ES), 2 mM de GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 01 mM de β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM de aminoácidos no esenciales MEM (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM de piruvato sódico (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% de penicilina-estreptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific). Se cambió el medio con 2 mL de medio de embrión reconstruido fresco cada día.

Los embriones de ETX se formaron de forma consistente y eficiente, los experimentos funcionales se pueden realizar sin selección de estructuras regulares o irregulares. Para los experimentos funcionales de ETX-embrioides y ETS-embrioides, seleccionamos las estructuras regulares basándonos en su morfología, y las proporciones y posiciones adecuadas de los compartimentos ESC y TSC mediante la indicación de TSC-EGFP en el microscopio de fluorescencia estéreo.

Recuperación de embriones de tipo salvaje y cultivo in vitro

Se recuperaron los blastocistos de ratones hembra preñados E4.5 mediante lavado uterino con M2 (MR-015-D, Millipore). Cultivo de embriones en medio IVC tras la eliminación del trofectodermo mural in vitro en μ-Slides de 8 pocillos (80826, Ibidi)62. Para la recuperación de embriones E5.5, E5.75 y E6.5, la disección de la decidua del útero se describe como el protocolo reportado63. Para los implantes EPI de ratones CD1 se diseccionaron en el día E5.0 como se informó anteriormente28 y se cultivaron con medio de embriones ETX in vitro.

Tinción de inmunofluorescencia

Los embriones de ratón y los embriones reconstruidos se fijaron con paraformaldehído al 4% (DingGuo, AR-0211) a 4 °C durante 20 minutos y se lavaron tres veces con un tampón de lavado (PBS que contenía 0,1% de Tween-20). A continuación, los embriones se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,5% (H5142, Promega) durante 30 minutos a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo (3% BSA, 0,3% Tritón X-100) durante una noche a 4 °C. Después de ser lavadas para eliminar los anticuerpos primarios no unidos, las células se incubaron con anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI, seguido de dos lavados con tampón de lavado, y luego se montaron en Fluoroshield Mounting Medium con DAPI (104140, abcam). Las imágenes se capturaron con un microscopio confocal Nikon A1.

Imágenes con procesamiento y análisis

Las imágenes de los embriones de ratón y de los embriones reconstruidos se adquirieron utilizando un microscopio confocal Nikon A1 con un objetivo de 20 × o 40 ×. Todos los análisis se llevaron a cabo utilizando el software de análisis de imágenes de código abierto »Fiji». Se estimó el volumen de los tejidos y el número de células de los embriones reconstruidos y de los embriones de tipo salvaje y también se realizaron mediciones de la intensidad de la inmunofluorescencia para el análisis de la distribución de PCX utilizando el software Fiji9.

PCR de células individuales de alto rendimiento y procesamiento de datos

Para el aislamiento de células individuales, se recogieron ciertas células en diferentes etapas de desarrollo (0, 24 y 84 h) de dos tipos de embriones ETX, que se reconstruyeron con líneas celulares informadoras Lefty1-mCherry XENC (LC-ETX-embriones) y BVSC ESC (BVSC-ETX-embriones), respectivamente. Para aislar las células individuales, sólo seleccionamos los embriones LC-ETX con tejidos tipo DVE/AVE identificados por la expresión asimétrica de las proteínas mCherry, y seleccionamos los embriones BVSC-ETX con expresión asimétrica de las proteínas mVenus en el compartimento ESC cerca del límite entre los compartimentos ESC y TSC. Para los embriones LC-ETX, se recogieron células derivadas de ESC negativas para LC (LC- XEN) de 0, 24 y 84 h, así como ESC positivas de 84 h (BVSC+ ES) del lado opuesto de LC- XEN. En el caso de los embriones BVSC-ETX, se recogieron células derivadas de ESC BV negativas (BVSC- ES) de 0, 24 y 84 h, así como ESC positivas (BVSC+ ES) del lado opuesto de BVSC- ES. Además, se recogieron células individuales de los compartimentos TSC en los ETX-embriones ensamblados con BVSC-ESCs a las 0, 24 y 84 h según el reportero EGFP.

Para la separación de células individuales, todos los ETX-embriones se incubaron en tripsina-EDTA al 0,1% (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) durante 5 min a 37 °C y luego se transfirieron al medio M2 (MR-015-D, Millipore). Tras repetidos y suaves pipeteos con la boca durante varias veces, se aislaron las células individuales con una punta de vidrio finamente estirada. Por término medio, se recogieron 30-40 células para cada tipo. Cada célula se lavó tres veces en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) que contenía un 0,1% de BSA (Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.), y se colocó en la mezcla maestra de transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para la lisis, la transcripción inversa específica de la secuencia y la preamplificación, como se describe en el informe anterior64.

Para el diseño y la validación de los cebadores, los genes que regulan la diferenciación del linaje celular (principalmente del estadio E3.5 al E6.5) y que participan en la vía de señalización dominante (p. ej, Wnt, vía de señalización Nodal) fueron seleccionados, según la embriogénesis del ratón. Las secuencias de ARNm de cada gen interesado se recuperaron del NCBI y sólo se utilizaron las regiones comunes para los genes con diferentes transcripciones. Los cebadores qRT específicos de los genes se diseñaron con el software Primer3 con una longitud de 100-250 pb. Todos los cebadores se probaron utilizando ADNc de embriones de ratón (mezcla de E5.5 y E6.5) para comprobar la eficacia y la especificidad de la amplificación (enumerados en los Datos complementarios 1).

Preamplificación específica de la secuencia de una sola célula, similar a un informe anterior65. Se agruparon un total de 96 conjuntos de cebadores a una concentración final de 0,1 μM para cada cebador. Las células individuales aisladas de los embriones se transfirieron a microtubos estériles cargados con 5 μL de mezcla maestra de RT-PCR que contenía 2,5 μL de mezcla de reacción CellsDirect (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.), 0,5 μL de conjunto de cebadores, 0,1 μL de enzima RT/Taq (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) y 1,9 μL de agua libre de nucleasas (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) en cada tubo. Los tubos se congelaron inmediatamente en hielo seco. Tras una breve centrifugación a 4 °C, los tubos se colocaron inmediatamente en la máquina de PCR. La lisis celular y la transcripción inversa específica de la secuencia se realizaron a 50 °C durante 1 h. Después, la inactivación de la transcriptasa inversa y la activación de la polimerasa Taq se lograron calentando a 95 °C durante 3 min. Posteriormente, en el mismo tubo, el ADNc se sometió a 20 ciclos de amplificación de secuencia específica mediante desnaturalización a 95 °C durante 15 s, y recocido y elongación a 60 °C durante 15 min. Para evitar la evaporación, los productos resultantes se almacenaron a -80 °C.

Para la PCR cuantitativa unicelular de alto rendimiento en microfluidos, todos los productos de ADNc preamplificados se validaron mediante el sistema de PCR en tiempo real (ABI 7500) utilizando el gen de control endógeno Actinb, y sólo se seleccionó el valor de cruce de umbral (Ct) dentro de 9 a 12 para el experimento posterior. Las muestras unicelulares amplificadas se analizaron con SsoFast EvaGreen Supermix con Low ROX (Bio-Rad, California, EE.UU.) y cebadores individuales de qPCR en arrays dinámicos de 96 × 96 en un Biomark System (Fluidigm, San Francisco, EE.UU.). El cálculo de los valores Ct se llevó a cabo con el software de análisis de PCR en tiempo real BioMark (Fluidigm, San Francisco, EE.UU.).

Para el procesamiento y la visualización de los datos de una sola célula, todos los valores Ct brutos obtenidos del sistema BioMark se convirtieron en niveles de expresión relativa Log2 restando los valores del valor Ct de fondo supuesto de 26. Las muestras con expresión baja o ausente de los genes de control endógenos (Actinb y Gapdh) se excluyeron del análisis posterior. Se aplicó PLS-DA a los datos de expresión para discriminar los grupos de células en diferentes embriones ETX con el paquete R mixOmics66. Se realizó una agrupación jerárquica utilizando distancias euclidianas, y se mostraron dendrogramas a lo largo de los mapas térmicos escalados por filas utilizando el paquete fluidigmSC. Se generaron gráficos de cajas y de violín con el software origin 8.6 y R.

Producción de embriones BVSC ESC-Chimeric

Produjimos los embriones BVSC ESC-Chimeric mediante el método de inyección de embriones de 8 células por micromanipulación piezoeléctrica67. Para asegurarnos de que los embriones huéspedes se inyectaran antes de la compactación, recogimos los embriones en la fase de dos células y los cultivamos in vitro. Para obtener embriones en fase de dos células, se superovularon ratones hembra de 5 semanas de edad mediante la inyección intraperitoneal de cinco unidades internacionales (UI) de PMSG, seguidas de 5 UI de HCG 46-48 h después, y se aparearon con ratones macho. Los embriones en fase de dos células se recogieron lavando el oviducto con M2 en E1,5. Los embriones se lavaron en M2 (MR-015-D, Millipore) y luego se transfirieron a gotas de 10 μL de KSOM (MR-020P-5F, Millipore) cubiertas con aceite mineral en una placa de cultivo de tejidos. Los embriones se mantuvieron a 37 °C con un 5% de CO2 en una incubadora.

Se inyectaron unas 15 células ES en embriones en fase de 8 células mediante micromanipulación piezoeléctrica67,68. Se utilizaron hembras CD1 de ocho semanas de edad apareadas con machos vasectomizados como ratones pseudopreñados. Los blastocistos inyectados se transfirieron al útero de las hembras pseudoembarazadas a los 2,5 días post coitum (dpc). Los embriones en fase de mórula con CME inyectadas se transfirieron al oviducto de las receptoras de 0,5 dpc. Se transfirieron entre 14 y 16 embriones por receptora. En E6.5, recogimos los embriones quiméricos de la decidua como se ha descrito anteriormente.

Transferencia de embriones y evaluación de la implantación

Se utilizaron hembras CD1 de ocho semanas de edad apareadas con machos vasectomizados como ratones pseudopreñados. Para los embriones reconstruidos, se transfirieron esferas reconstruidas de 36 h (ETX-, ETS- y EXE-embriones) en los cuernos uterinos de ratones hembra CD1 receptores pseudopreñados a los 2,5 dpc o 3,5 dpc. Se transfirieron entre 16 y 20 embriones por receptora. Los lugares de implantación en el día 6,5 se identificaron y contaron mediante la inyección intravenosa de 100 μL de solución Chicago Sky Blue al 1%. La longitud y el radio de cada decidua se midió utilizando un software de análisis de imágenes, y el volumen se calculó a partir de estas mediciones como V = πr2l.

Tinción con HE e inmunotinción de los sitios de implantación

Para examinar el potencial de desarrollo de los embriones autoensamblados, recogimos deciduas de diversas etapas, incluyendo 48, 72 y 84 h después del trasplante. Estas muestras de embriones reconstruidos (ETX, EXE y ETS) se fijaron con paraformaldehído al 4% durante una noche a 4 °C, se deshidrataron con alcoholes de gradiente, se transfirieron a xileno y se incrustaron en parafina. Se utilizaron embriones de tipo salvaje E5.5, E6.0 y E6.5 como control. Las muestras se cortaron a 5 μm de grosor, se tiñeron con hematoxilina y eosina y se observaron al microscopio. Las muestras rehidratadas y desparafinadas se sometieron a una recuperación de epítopos inducida por calor en tampón de citrato a unos 95 °C mediante un horno de microondas durante 10 minutos, tras lo cual se enfriaron a temperatura ambiente y se enjuagaron dos veces en PBS con 3 minutos por dos. La permeabilización se realizó con Tritón X-100 al 0,5% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tras la permeabilización, las muestras se lavaron en PBS durante tres veces (3 min cada una). A continuación, las muestras se bloquearon durante 30 minutos con albúmina de suero bovino (BSA) al 5% en PBS y se incubaron con anticuerpos primarios contra Rabbit anti-CK (ab9377, Abcam), Rabbit anti-COX2 (ab15191, Abcam), Rabbit anti-Laminin (L9393, Sigma), Goat anti-Gata4 (sc-1237, Santa Cruz), o Mouse anti-PL1(sc-376436, Santa Cruz) a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, los cortes se lavaron tres veces en PBS durante 5 minutos y se incubaron con el anticuerpo secundario durante 30 minutos a 37 °C. Los anticuerpos secundarios se marcaron con Alexa Fluorophore 488 o 594 (Invitrogen). Posteriormente, las secciones se enjuagaron seis veces en PBS durante 5 minutos cada una y se montaron con el medio de montaje Fluoroshield con DAPI (ab104140, Abcam). Los portaobjetos se mantuvieron a -20 °C hasta su observación. Las imágenes se capturaron con un microscopio fluorescente Leica.

Hibridación in situ

La hibridación in situ con digoxigenina (DIG) se realizó en criosecciones52. Para la hibridación se utilizaron sondas de ARNc específicas de ratón para Dtprp. Las secciones hibridadas con sondas de sentido sirvieron como controles negativos. Las secciones congeladas (8-10 μm) se adhirieron a portaobjetos recubiertos de poli-l-lisina (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, China) y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Las secciones se colocaron en un calentador de portaobjetos (37 °C) durante 2 minutos y luego se rehidrataron en PBS, se posfijaron en PFA al 4% durante 15 minutos a 4 °C, se trataron con proteinasa K (15 μg por mL durante 5 minutos a temperatura ambiente), se acetilaron al 0,25% durante 10 minutos y se hibridaron con sondas marcadas con DIG durante una noche a 65 °C. Se realizaron dos lavados posteriores a la hibridación a 65 °C, seguidos de dos lavados en 1 × MABT, y 30 min de tratamiento con RNasa (20 μg por mL) a 37 °C. Las secciones se bloquearon durante 1 h y se incubaron durante la noche en bloque con un anticuerpo anti-DIG (1:2500, Sigma-Aldrich). Tras el lavado, se reveló el color con NBT/BCIP hasta que se hizo visible un precipitado marrón. Los portaobjetos se contrateñaron con rojo rápido nuclear, se deshidrataron y aclararon en xileno, y se montaron en medio de montaje citológico. Las fotografías se tomaron inmediatamente antes de que se produjera el desvanecimiento del precipitado INT/BCIP.

Identificación del genotipo de los embriones autoensamblados transferidos

El ADN genómico se extrajo de los DsRed-ESCs, EGFP-TSCs y ETX-embriones aislados de los tejidos de la decidua utilizando un kit de ADN TIANamp Micro (DP316, Tiangen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El conjunto de cebadores de diagnóstico EGFP (5ʹ-AGGACGTCATCAAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATAGTCTTCTG-3ʹ) y DsRed (5ʹ-GTGCTTCAGCCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCACCTTGATGCCGTTCT-3ʹ) se utilizaron para identificar la región de las células y las muestras por PCR. El perfil térmico fue de 95 °C durante 5 min, 35 ciclos de 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 20 o 40 s, y un ciclo final a 72 °C durante 5 min.

Estadísticas

Los análisis estadísticos se procesaron en el software GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA) para Windows (incluidos los datos de expresión Log2 de una sola célula). Se comprobó que los datos tuvieran una distribución normal y varianzas iguales con la prueba F antes de realizar cada prueba estadística paramétrica. En su caso, se realizaron pruebas t de Student de dos colas con la corrección de Welch si la varianza entre los grupos no era igual. Las barras de error representan el error estándar del m.e.s. o del d.s., según se especifique. Las leyendas de las figuras indican el número de experimentos independientes realizados en cada análisis. Cada experimento se repitió para garantizar la reproducibilidad.

El volumen del tejido (Figs. 1i y 7c, y Fig. Suplementaria 4h), el porcentaje y el cálculo del número (Figs. 2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m y 7n; Figs. Suplementaria 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a y 12g) se determinó utilizando Excel. El análisis de significación se realizó mediante la prueba t de GraphPad Prism. Los gráficos de barras se dibujaron con Excel y GraphPad Prism, y los gráficos de dispersión se trazaron con GraphPad Prism.

Resumen del informe

Más información sobre el diseño experimental está disponible en el resumen del informe de Nature Research vinculado a este artículo.