Mice

全ての動物処置および全てのマウス作業は中国農業大学動物管理および使用委員会によって承認されています (Permit Number: SKLAB-2016-01-04)． CD1マウスおよび129マウスは、北京バイタルリバー・ラボラトリー・アニマル・テクノロジー株式会社から入手した。 Actin-GFPマウスは、同済大学のShaorong Gaoの研究室から入手した。 すべてのマウスは、水と餌に自由にアクセスできる温度制御された部屋（22±2℃）で、06:00から18:00までの12時間暗/12時間明サイクルの特定病原体フリー（SPF）条件で維持された。

幹細胞株および細胞培養

G4 および G4-ACTB-DsRed-MST ESCは、マウントサイナイ病院 & Samuel Lunemfeld Research InstituteのAndras Nagy博士、Kristina VinterstenおよびMarina Gertsensteinの研究所から入手した。 Blimp1-mVenusおよびStella-ECFP（BVSC）二重トランスジェニックESC株は、Prdm1制御要素（Blimp1）の下で膜標的Venus（mVenus）を、Dppa3制御下で強化CFP（ECFP）（Stella/Pgc7）を発現しており、斉藤美典博士から得られた45，46．

Lefty1-mCherryマウスXEN細胞株の作製には、Lefty1プロモーターと蛍光タンパク質を用いて、pT2/LTR7-GFPを改変したトランスポゾンベクター (addgene#62541) とトランスポラーゼベクター (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879) から成るSleeping Beauty transposon systemによってXEN細胞への組み込みを行った。 PT2/LTR7-GFPは、puromycin N-acetyltransferaseを発現できる「puro」城を加え、GFPのCDS領域をmCherryに置き換えた。 pT2/LTR7-GFPからプライマー PT2-F (GTTTGGACAAACCACAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACATCATTTTCTG) で増幅したDNA断片に、puro castleとmCherry CDS領域を結合してNEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs) で PT2-Puro-mCherry というベクターを取得しました。 Lefty1遺伝子のプロモーター配列は、Lefty1-F (GTCCGGTGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTTGAGTCTGCGG) を用いてマウスES細胞のDNAから増幅されたものである。 その後、NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs) により、PT2-Puro-mCherry を EcoRI により直鎖化し、Lefty1 遺伝子のプロモーター配列に EcoRI 配列を含むオーバーラップ配列を付加した。 このベクターをPT2-Puro-mCherry-Lefty1と命名した。 次に、PT2-Puro-mCherry-Lefty1とpCMV(CAT)T7-SB100をマウスXEN細胞にトランスフェクトし、2μg/mL puromycinによってスクリーニングし、その後の解析に使用した。

Lamc1（ラミニン、ガンマ1）ノックアウト細胞株の作製には、Lamc1のエクソン1を標的とする2つのsgRNA配列（GGAGTACTGCGTGCAGACTGGGとGCTTTGCCACCAGTGGTGTCGG）により、二重sgRNAベクターを構築した。 プライマー（Lamc1sg1-F：atgcgtctcacggagtactgcagactggttagctagaaatagcaag、Lamc1sg2-R：atgcgtctcgaaacacctggtggtcgtcctccaag）でPUC-U6-sgRNA-Kana（Huang Xingxu labより）から増幅した2つのsgRNA配列含む断片を使用した。 PCR産物をBsmbIで消化し、直鎖化したPX330-GFPとライゲーションした。 このVectorをLipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific)を用いてESCsとXENCsにそれぞれトランスフェクションした。 その後、GFP陽性細胞をフローサイトメトリーで選別し、モノクローナル増殖のために希釈した。 得られたモノクローナル細胞からDNAを抽出し、PCR増幅とシークエンスに供した。 6202>

Nodalノックアウト細胞株の作製には、Nodalのexon1を標的とするgRNA配列(GCCCTCGTCACCGTCCCCTCTGG)を用いてsgRNAベクターを構築した。 Nodal sgRNAのプライマー（Nodal-sgF: caccgccctcgtcaccgcccctc and Nodal-sgR: aaacgaggggacggtgacgagggc）をアニールし、アニール産物をBbsIによって直線化PX330-GFPとライゲーションさせた。 このVectorをLipofectamine 3000を用いてESCにトランスフェクトし、GFP陽性細胞をフローサイトメトリーで選別し、希釈してモノクローナル増殖させた。 得られたモノクローナル細胞からDNAを抽出し、PCR増幅とシークエンスに供した。 ノックアウト陽性細胞はフォローアップ実験のために選択した。

p53ノックアウトESC株の作製は、p53変異のsgRNA配列をCRISPR-Cas9 system59を用いてPX330-GFP vector (addgene, #48138) にcloneし、p53変異させた。 このベクターを Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific) により G4 ESCs にトランスフェクションした． トランスフェクションから3日後、GFP陽性細胞をソートし、6ウェルプレートにプレーティングした。 コロニーを摘出し、プライマー（F: CATCCAGGCGGAAATAGAC; R: CCTGACTGTGTAACTAGC）を用いてPCRによりノックアウト領域を増幅し、塩基配列を決定した。 野生型配列と整列させることにより、ホモ接合体ノックアウト細胞コロニーを同定し、さらなる研究のために選択した。

ESCは、15％（v／v）FBS（Gibco、ES細胞適格）、2mM GlutaMAX（35050061、サーモフィッシャーサイエンティフィック）、0.を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（11960069、サーモフィッシャーサイエンティフィック）において培養された。1 mM β-メルカプトエタノール（21985-023、Thermo Fisher Scientific）、0.mM MEM非必須アミノ酸（11140050、Thermo Fisher Scientific）、1mMピルビン酸ナトリウム（11360070、Thermo Fisher Scientific）、1％ペニシリン-ストレプトマイシン（15140122、Thermo Fisher Scientific）、1000IU LIF（130-099-895, Miltenyi Biotec）、1μM PD0325901（4423、Tocris）および3μM CHIR99021（4192, Tocris）であった。 6202>

TSCs は、5 週齢の CD1 マウス雌の子宮から流出した E3.5 芽球に由来する15,60. この胚盤胞は、分裂を停止させたマウスMEF細胞（フィーダー細胞）を用いて、TSC培養液：20% (v/v) FBS (Gibco, ES cell qualified), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.5 mM GlutaMAX (35050061) を添加した上級RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) で培養した。1 mM β-メルカプトエタノール（21985-023、Thermo Fisher Scientific）、1 mM ピルビン酸ナトリウム（11360070、Thermo Fisher Scientific）、1％（v／v）ペニシリン-ストレプトマイシン（15140122、Thermo Fisher Scientific）、25 ng／mL リコンビナントヒトFGF4（235-F4-025、R＜332＞D）および1μg／mL ヘパリン（07980、Stem Cell）である。 4日目に形成されたアウトグロースまでは、その後、インキュベーター内で0.1%トリプシン-EDTAで5分間インキュベートすることにより解離させた。 FGF4とヘパリンを含む新鮮なマウス70%胚性線維芽細胞調整培地を加えて反応を止め、インキュベーターに戻す。 TS細胞のコロニーが観察できるようになるまで1日おきに培地を交換し、TSC培養液で培地を交換して細胞を維持する。 EGFPを発現するTSC（TSC-EGFP）細胞株は、JetPrime（114-15、Polyplus transfection）によりPB-UBC-EGFPベクターを導入した野生型TSCに由来するものである。 TSCsは、37℃、5% CO2で、ゲル化およびフィーダー被覆した組織培養グレードウェルプレートを用いて培養し、80%コンフルエントに達した時点で継代した。 6202>

XENCは、5週齢の雌129マウスの子宮から流出したE3.5胚盤胞から、修正XENC条件61を用いて誘導した。 マウス胚盤胞をフィーダー細胞上で4日目に外胚葉が形成されるまで培養し、その後インキュベーター内で0.1%トリプシン-EDTAで5分間インキュベートし、外胚葉を分解した。 PD0325901 と CHIR99021 を含まない新しいマウス ES 細胞培地を加えて反応を停止させ、XEN 細胞のコロニーが観察できるようになるまで、1 日おきに培地を交換する。 XEN細胞コロニーは、標準XEN培地：15% (v/v) FBS (Gibco) および 0.1 mM β-mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific)、 1% penicillin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific) 添加の上級RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific)で維持された。 XENC-EGFP細胞株は、Actin-EGFPマウス胚盤胞から直接得られたものである。 フィーダーレス培養のため、XENCはゼラチンでコーティングした組織培養グレードのウェルプレート上で維持された。 XEN細胞は、37℃、5% CO2で培養した。 90%のコンフルエントに達した時点で継代した。 培養液は毎日交換した。

自己組織化胚の生成

80%コンフルエントに達したESCをPBS (14190-094, Gibco) で一度洗浄し、TrypLE (12605010, Thermo Fisher Scientific) で37℃にて5分間インキュベートした。 TSCsとXENCsは、0.1％トリプシン-EDTA（25300054、Thermo Fisher Scientific）と37℃でインキュベートすることにより、単細胞に解離させた。 1000rpm、5分間の遠心分離により細胞をペレット化した。 このペレットを再構築胚培地にピペッティングにより再懸濁し、単一細胞にした。 この細胞は、自動セルカウンターで自動的に計数された。

ETX-胚は、ESC、TSC、XNECをそれぞれ1×105、1×105、2×105の細胞数で混合（ETS-胚は、ESC、TSCをそれぞれ1×105、1×105の細胞数で混合。 EXE-embryoids は、ESC と XENC をそれぞれ 1 × 105 と 1 × 105 で混合）、35 mm の無処理細胞培養ディッシュに 2 mL の再構築胚培地を加える。 37℃、5% CO2、100%湿度の環境下で、ディッシュを水平ローテーター上に移動させる。 回転数は 60 rpm/min である。 再構成胚培地は、39％の高度RPMI1640（11875-093、サーモフィッシャーサイエンティフィック）および39％のDMEM（11960069、サーモフィッシャーサイエンティフィック）サプリメントに17．5％のFBS（Gibco、ES細胞適格）、2mM GlutaMAX（35050061、サーモフィッシャーサイエンティフィック）、0.1 mM β-メルカプトエタノール（21985-023、Thermo Fisher Scientific）、0.1 mM MEM 非必須アミノ酸（11140050、Thermo Fisher Scientific）、1 mM ピルビン酸ナトリウム（11360070、Thermo Fisher Scientific）、1％ペニシリン-ストレプトマイシン（15140122、Thermo Fisher Scientific）。 6202>

EXE-embryoids は安定かつ効率的に形成され、規則正しい構造や不規則な構造を選択することなく機能実験を行うことができる。 ETX-embryoids と ETS-embryoids の機能実験では、形態から規則正しい構造を選択し、実体蛍光顕微鏡下で TSC-EGFP を表示して ESC と TSC コンパートメントの割合と位置が適切であることを確認した。

野生型胚の回収と体外培養

E4.5過排卵妊娠雌マウスからM2（MR-015-D、ミリポア）で子宮洗浄し、胚盤胞を回収した。 8-well μ-Slides（80826、Ibidi）上でin vitroで壁側中胚葉を除去した後、IVC培地で胚を培養する62。 E5.5, E5.75, E6.5 胚の回収は、子宮からの剥離は報告されているプロトコールと同様63. CD1マウスからのEPI-explantsは、以前の報告28と同様にE5.0日目に解剖し、in vitroでETX-embryoids培地で培養した。

免疫蛍光染色

マウス胚および再構成胚を4％パラホルムアルデヒド（DingGuo、AR-0211）で4℃、20分間固定し、洗浄バッファ（PBS containing 0.1%Tween-20) で3回洗浄した。 その後，胚を 0.5% Triton X-100 (H5142, Promega) で室温 30 分間透過させ，一次抗体とともにブロッキングバッファー (3% BSA, 0.3% Triton X-100) で 4℃，一晩インキュベートした． 結合しなかった一次抗体を除去するために洗浄した後、二次抗体とブロッキングバッファー中で4 °Cで一晩インキュベートした。 細胞核をDAPIで染色し、洗浄液で2回洗浄した後、DAPI入りFluoroshield Mounting Medium (104140, abcam)でマウントした。 画像はNikon A1共焦点顕微鏡で撮影した。

画像処理と解析

マウス胚と再構成胚の画像は、20×または40×対物レンズを備えたNikon A1共焦点顕微鏡で取得した。 すべての解析はオープンソースの画像解析ソフト”Fiji”を用いて行った。 再構成胚と野生型胚の組織体積と細胞数を推定し、PCX分布解析のための免疫蛍光強度測定もFijiソフトウェアを使って行った9。

ハイスループット単一細胞qPCRおよびデータ処理

単一細胞の分離のために、異なる発生段階（0、24、84時間）の特定の細胞を、それぞれLefty1-mCherry XENC（LC-ETX-embryoids） およびBVSC ESC（BVSC-ETX-embryoids） 記者細胞ラインで再構成された2タイプのETX-胚から収集した。 単細胞の分離は、mCherryタンパク質の非対称発現で識別されるDVE/AVE様組織を持つLC-ETX-胚葉のみを選択し、ESC-区画とTSC区画の境界付近でmVenusタンパク質が非対称発現しているBVSC-ETX-胚葉を選択する。 LC-ETX-embryoids については、0、24、84 時間経過した LC 陰性 ESC 由来細胞（LC- XEN）と、LC- XEN の反対側の 84 時間経過した陽性 ESC（BVSC+ ES）を収集した。 BVSC-ETX-胚については、0、24、84時間のBV陰性ESC由来細胞（BVSC- ES）、およびBVSC- ESの反対側の84時間の陽性ESC（BVSC+ ES）を採取した。 さらに、BVSC-ESCで組み立てた0、24、84時間のETX-胚のTSCコンパートメントから、EGFPレポーターに基づいて単一細胞を集めた。

単一細胞の分離のために、すべてのETX-胚を0.1%トリプシン-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, USA) で37℃で5分間培養し、M2培地 (MR-015-D, Millipore) に移し替えた。 穏やかに数回マウスピペットを繰り返した後、細かく引いたガラスチップで単一細胞を単離した。 平均して、1種類につき30-40個の細胞を集めた。 各細胞は、0.1% BSA (Sigma-Aldrich, MO, USA) を含む Dulbecco’s phosphate-buffered saline (Invitrogen, Carlsbad, USA) で3回洗浄し、以前の報告64と同様に、溶解、配列特異的逆転写、前増幅のための逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) マスターミックスの中に入れた。

プライマーの設計と検証には、細胞系列分化（主にE3.5期からE6.5期）を制御し、支配的なシグナル伝達経路に関与する遺伝子（例えば, Wnt、Nodalシグナルなど）に関与する遺伝子をマウスの胚発生に即して選択した。 各遺伝子のmRNA配列はNCBIから検索し、転写産物が異なる遺伝子は共通領域のみを使用した。 遺伝子特異的なqRT-primerはPrimer3ソフトウェアで100-250 bpの長さで設計された。 すべてのプライマーは、マウス胚（E5.5とE6.5の混合）のcDNAを用いて増幅効率と特異性をテストした（補足データ1に記載）

Single-cell sequence-specific preamplification similar to previous report65. 合計96のプライマーセットをプールし、各プライマーの最終濃度が0.1μMになるようにした。 胚から単離した個々の細胞を、各チューブに2.5μLのCellsDirect反応ミックス（Invitrogen, Carlsbad, USA）、0.5μLのプライマープール、0.1μLのRT/Taq酵素（Invitrogen, Carlsbad, USA）および1.9μLの核酸除去水（Invitrogen, Carlsbad, USA）を含む5μLのRT-PCRマスターミックスが装填された無菌マイクロチューブ内に移した。 チューブは直ちにドライアイス上で凍結した。 4 ℃で短時間遠心した後、チューブを直ちにPCR装置にセットした。 細胞溶解と配列特異的逆転写は50℃で1時間行った。その後、95℃で3分間加熱することにより逆転写酵素の不活性化とTaqポリメラーゼの活性化を達成した。 その後、同じチューブ内で、95 ℃で15秒間の変性、60 ℃で15分間のアニーリングと伸長による配列特異的増幅を20サイクル行い、cDNAを得た。 ハイスループットなマイクロ流体単一細胞定量PCRのために、すべての前増幅cDNA産物は、内在性対照遺伝子Actinbを用いてリアルタイムPCRシステム（ABI 7500）で検証され、9から12以内の閾値交差（Ct）値のみがその後の実験に選択された。 増幅された単一細胞サンプルは、SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX (Bio-Rad, California, USA) と個々のqPCRプライマーを用いて、Biomark System (Fluidigm, San Francisco, USA) 上の96 × 96 dynamic arraysで解析された。 Ct値の計算はBioMark Real-Time PCR Analysis software (Fluidigm, San Francisco, USA)で行った。

シングルセルデータ処理と視覚化のために、BioMark Systemから得たすべての生のCt値は、想定したバックグラウンドCt値26から値を差し引くことによってLog2相対発現レベルに変換された。 内因性コントロール遺伝子（ActinbとGapdh）の発現が低いか、ないサンプルは、その後の解析から除外した。 RパッケージのmixOmics66を用いて、異なるETX-胚の細胞群を識別するために、発現データにPLS-DAが適用された。 ユークリッド距離を用いて階層的クラスタリングを行い、fluidigmSC パッケージを用いて、行スケールのヒートマップに沿ってデンドログラムを表示した。 6202>

BVSC ESC-Chimeric胚の作製

BVSC ESC-Chimeric胚はPiezo Micromanipulationによる8細胞胚注入法で作製した67． 宿主胚がコンパクション前に注入されたことを確認するため、2細胞期の胚を回収し、体外培養を行った。 2細胞期胚を得るために，5週齢の雌マウスに5国際単位（IU）のPMSGを腹腔内投与し，46-48時間後に5IUのHCGを投与して過排卵し，雄マウスと交配させた。 E1.5で卵管をM2でフラッシュすることにより2細胞期胚を採取した。 胚をM2（MR-015-D、Millipore）で洗浄し、組織培養皿上の鉱油で覆われた10μLのKSOM（MR-020P-5F、Millipore）滴に移した。 6202>

約15個のES細胞をPiezo Micromanipulation67,68によって8細胞期胚に注入した。 精管切除した雄と交配した8週齢のCD1雌を擬似妊娠マウスとして使用した。 注射した胚盤胞は、分娩後2.5日目（dpc）の擬妊娠雌の子宮に移植した。 ESCを注入したモルラ期の胚は、0.5dpcのレシピエントの卵管に移植した。 そして、1人のレシピエントにつき14-16個の胚を移植した。 E6.5で、上記のようにデシデュエからキメラ胚を採取した。

胚移植と着床評価

パイプカット雄と交配した8週齢CD1雌を仮妊娠マウスとして使用した。 再構築胚は、36時間再構築した球体（ETX-、ETS-、EXE-胚）を2.5 dpcまたは3.5 dpcの仮妊娠レシピエントCD1雌マウスの子宮角へ移植した。 レシピエント1匹につき16〜20個の胚を移植した。 6.5日目の着床部位を100μLの1% Chicago Sky Blue溶液の静脈内注射により同定し、計数した。 6202＞＜6240＞着床部のHE染色と免疫染色＜8643＞＜6662＞自己組織化胚の発生能を調べるため、移植後48、72、84時間など多様なステージのデシドゥアを採取した。 これらの再構築胚（ETX、EXE、ETS）試料を4％パラホルムアルデヒドで4℃、一晩固定し、勾配アルコールで脱水後、キシレンに移し、パラフィンに包埋した。 対照として、E5.5, E6.0, E6.5 の野生型胚を使用した。 試料は5μmの厚さにスライスし，ヘマトキシリン・エオジンで染色し，顕微鏡で観察した． 脱パラフィンした再水和試料は、電子レンジによりクエン酸緩衝液中で約95℃、10分間の熱によるエピトープ回収を行い、その後室温まで冷却し、PBSで3分間×2回のリンスを行った。 透析は、PBS中の0.5% Triton X-100で20分間、室温で行った。 透過処理後、試料をPBSで3回洗浄した（各3分間）。 次に、試料をPBS中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）で30分間ブロックし、ウサギ抗CK（ab9377、アブカム）、ウサギ抗COX2（ab15191、アブカム）、ウサギ抗ラミニン（L9393、シグマ）、ヤギ抗Gata4（sc-1237、サンタクルーズ）またはマウス抗PL1（sc-376436、サンタクルーズ）に対して一次抗体で4℃、一晩インキュベートした。 翌日、スライスをPBSで5分間3回洗浄し、二次抗体と37℃で30分間インキュベートした。 二次抗体はAlexa Fluorophore 488または594(Invitrogen)で標識した。 その後，切片をPBSで5分ずつ6回洗浄し，DAPI入りFluoroshield mounting medium (ab104140, Abcam)でマウントした． スライドは観察するまで-20℃で保存した。 画像はLeica蛍光顕微鏡で撮影した。

In situ hybridization

In situ hybridization with digoxygenin (DIG) は凍結切片で実施した52。 Dtprpのマウス特異的cRNAプローブがハイブリダイゼーションに用いられた。 センスプローブでハイブリダイゼーションした切片はネガティブコントロールとして使用した。 凍結切片（8-10μm）をポリ-L-リジンコートスライド（Citotest Labware Manufacturing Co. 切片をスライドウォーマー（37 ℃）に2分間置いた後、PBSで再水和し、4％PFAで4℃、15分間後固定し、プロテイナーゼK（15μg/mL、室温、5分間）で処理し、0.25％アセチル化、DIG標識プローブで65℃、一晩ハイブリダイゼーションした。 65℃ポストハイブリダイゼーション洗浄を2回行い、その後1×MABTで2回洗浄し、37℃で30分間RNase処理（20μg/mL）した。 切片を1時間ブロッキングし、抗DIG抗体（1:2500, Sigma-Aldrich）と共にブロック内で一晩インキュベートした。 洗浄後、NBT/BCIPを用いて、茶色の沈殿が見えるまで発色させた。 スライドをnuclear fast redで対比染色し、キシレンで脱水・清拭し、サイトシール・マウント媒体でマウントした。

移植した自己組織化胚の遺伝子型の同定

ゲノムDNAは、TIANamp Micro DNA Kit (DP316, Tiangen)を用いて、デシデュア組織から分離したDsRed-ESC、EGFP-TSCおよびETX-胚珠から製造者の説明書に従って抽出した。 診断用プライマーセットEGFP（5ʹAGGACGTCATCAAGGAGTTC-3ʹ、5ʹCAGCCCATTCTTCTG-3ʹ）およびDsRed（5ʹ-GTGCTTCAGCCGCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCACCTTGATGCCGTTCT-3ʹ)を用い、PCRにより細胞やサンプルの領域を特定することができた。 熱プロファイルは、95℃ 5分、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 20または40秒の35サイクル、72℃ 5分の最終サイクルとした。

統計

統計分析は、Windows用 GraphPad Prism 7.0 ソフトウェア (GraphPad Software, La Jolla, CA) で処理した（単一細胞のLog2発現データも含まれる）。 データは、各パラメトリック統計検定を実行する前に、F-testで正規分布と等分散性をチェックした。 グループ間の分散が等しくない場合は、Welchの補正を行い、両側Studentのt-testを実施した。 エラーバーは、指定されたs.e.m.またはs.d.の標準誤差を表す。 図の説明には、各解析で行った独立した実験の数を示した。 各実験は再現性のために繰り返した。

組織体積（図1iおよび7c、補図4h）、百分率および数の計算（図2h、2i、3k、4c、4f、5e、5f、7b、7m、7n、補図2d、3c、4g、8d、11f、12aおよび12g）はExcelを用いて決定した。 有意性解析はGraphPad Prismによるt-testで行った。 棒グラフはExcelとGraphPad Prismで描き、散布図はGraphPad Prismで描いた。

Reporting summary

実験デザインに関するさらなる情報は、この論文にリンクしたNature Research Reporting Summaryに掲載されている。