Muizen

Alle dierprocedures en al het muizenwerk werden goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van China Agriculture University (Permit Number: SKLAB-2016-01-04). CD1 en 129 muizen werden verkregen uit Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co, Ltd. Actin-GFP muizen werden verkregen uit Shaorong Gao’s Laboratory in Tongji University. Alle muizen werden gehouden in specifieke pathogeen-vrije (SPF) omstandigheden met een 12-h donker / 12-h licht cyclus tussen 06:00 en 18:00 in een temperatuur gecontroleerde ruimte (22 ± 2 ° C) met vrije toegang tot water en voedsel.

Stem cellijnen en celkweek

G4 en G4-ACTB-DsRed-MST ESC’s werden verkregen van Dr Andras Nagy, Kristina Vintersten en Marina Gertsenstein’s Laboratorium in Mount Sinai Hospital & de Samuel Lunemfeld Research Institute. Blimp1-mVenus en Stella-ECFP (BVSC) dubbel-transgene ESC-lijn, die membraan-gerichte Venus (mVenus) onder de controle van Prdm1 (Blimp1) regulerende elementen en versterkt CFP (ECFP) onder de controle van Dppa3 (Stella / Pgc7) tot expressie brengen, werden verkregen van Dr Mitinori Saitou 45,46.

Voor de generatie van Lefty1-mCherry muis XEN cellijn, werden de Lefty1 promotor en fluorescerende proteïne gebruikt om te integreren in XEN cellen door de Sleeping Beauty transposon systeem, dat bestaat uit twee componenten: de transposon vector gemodificeerd van pT2/LTR7-GFP (addgene # 62541) en de transposase vector (pCMV (CAT) T7-SB100, addgene # 34879). PT2/LTR7-GFP werd toegevoegd met “puro” kasteel, dat puromycine N-acetyltransferase tot expressie kan brengen en GFP CDS regio werd vervangen door mCherry. DNA-fragment, dat werd geamplificeerd uit pT2/LTR7-GFP met primer PT2-F (GTTTGGACAAACCACAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACATCATTTTCTG), gekoppeld aan “puro” castle en mCherry CDS-regio om de vector genaamd PT2-Puro-mCherry te verkrijgen met behulp van NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs). De promotorsequentie van het Lefty1-gen werd uit het DNA van muis-ES-cellen geamplificeerd met Lefty1-F (GTCCGGTGGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTTGAGTCTGCGG). Vervolgens werd de promotorsequentie van het Lefty1-gen toegevoegd aan PT2-Puro-mCherry met behulp van NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs), waarin PT2-Puro-mCherry werd gelineariseerd door EcoRI en de overlapsequentie die EcoRI-sequentie bevatte werd toegevoegd aan de promotorsequentie van het Lefty1-gen. De vector kreeg de naam PT2-Puro-mCherry-Lefty1. Vervolgens werden PT2-Puro-mCherry-Lefty1 en pCMV(CAT)T7-SB100 getransfecteerd in muis XEN cellen en gescreend met 2 μg per ml puromycine voor verdere analyses.

Voor de generatie van Lamc1 (laminine, gamma 1) knock-out cellijnen, twee sgRNA sequentie gericht (GGAGTACTGCGTGCAGACTGGGG en GCTTTGCCACCAGGTGGTGTCGG) Lamc1 exon1 werden gebruikt voor de bouw van een dubbele sgRNA vector. Fragmenten die twee sgRNA sequenties geamplificeerd uit PUC-U6-sgRNA-Kana (van Huang Xingxu lab) met behulp van primers (Lamc1sg1-F: atgcgtctcacaccggagtactgcgtgcagactggttagagagctaatagcaag en Lamc1sg2-R: atgcgtctcgaaacaccacctggtggcaaagcggtttcgtcgtcctttccacaag). Het PCR-product werd gedigesteerd met BsmbI en geligeerd met gelineariseerd PX330-GFP. De vectoren werden getransfecteerd in ESC’s en XENC’s met behulp van Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific), respectievelijk. Vervolgens werden de GFP-positieve cellen gesorteerd met behulp van flowcytometrie en verdund voor monoklonale groei. DNA werd geëxtraheerd uit de verkregen monoklonale cellen en onderworpen aan PCR amplificatie en sequencing. Knock-out-positieve cellen werden geselecteerd voor vervolgexperimenten.

Voor het genereren van Nodal knock-out cellijnen, werden gRNA-sequenties gericht op (GCCCTCGTCACCGTCCCCTCTGG) Nodal’s exon1 gebruikt voor de bouw van sgRNA vector. Primers voor Nodal sgRNA (Nodal-sgF: caccgccctcgtcaccgtcccctc en Nodal-sgR: aaacgaggggacggtgacgagggc) werden geannealed en het geannealde product werd geligeerd aan gelineariseerde PX330-GFP door BbsI. De vectoren werden getransfecteerd in ESC’s met Lipofectamine 3000 en de GFP-positieve cellen werden gesorteerd met behulp van flowcytometrie en verdund voor monoklonale groei. DNA werd geëxtraheerd uit de verkregen monoklonale cellen en onderworpen aan PCR amplificatie en sequencing. Knock-out-positieve cellen werden geselecteerd voor follow-up experimenten.

Voor de generatie van p53 knock-out ESC lijn, werd de sgRNA-sequentie voor p53 mutatie gekloond in de PX330-GFP vector (addgene, #48138) met CRISPR-Cas9 systeem59. De vector werd getransfecteerd in G4 ESCs door Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Drie dagen na transfectie, werden GFP-positieve cellen gesorteerd en uitgezet op 6-well plaat. Kolonies werden geplukt, en de knock-out regio’s werden geamplificeerd door PCR met primers (F: CATCCAGGCGGGAAATAGAC; R: CCTGACTGTGTAAACTAGGC) en gesequenced. Door uitlijning met de wild-type sequentie werden homozygote knock-out celkolonies geïdentificeerd en geselecteerd voor verdere studie.

ESC’s werden gekweekt in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) met 15% (v/v) FBS (Gibco, ES-cel gekwalificeerd), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM niet-essentiële aminozuren (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natriumpyruvaat (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicilline-streptomycine (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1000 IE LIF (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM PD0325901 (4423, Tocris), en 3 µM CHIR99021 (4192, Tocris). ESC’s werden gekweekt bij 37 ° C en 5% CO2 op gegelatineerde en feeder-bedekte weefselkweek graad well platen, en gepasseerd wanneer 80% confluentie is bereikt.

TSC’s werden afgeleid van E3,5 blastocysten gespoeld uit de baarmoeder van 5-weken oude vrouwelijke CD1 muis15,60. De blastocysten werden gekweekt bij 37 ° C en 5% CO2 op gegelatineerde en feeder-bedekte weefselkweek graad well platen, en gepasseerd wanneer 80% confluentie is bereikt. De blastocysten werden gekweekt op mitotisch geïnactiveerde muis MEF-cellen (feeder-cellen) met TSC cultuur medium: geavanceerde RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) aangevuld met 20% (v / v) FBS (Gibco, ES-cel gekwalificeerd), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natriumpyruvaat (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% (v/v) penicilline-streptomycine (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng per mL recombinant humaan FGF4 (235-F4-025, R&D) en 1 µg per mL heparine (07980, Stem Cell). Tot de uitgroei gevormd op dag 4, werden ze vervolgens uit elkaar gehaald door geïncubeerd in 0,1% trypsine-EDTA gedurende 5 min in de incubator. Voeg vers muis 70% embryonale fibroblast geconditioneerd medium met FGF4 en heparine om de reactie te stoppen en terug te keren naar de incubator. Vervang het medium om de andere dag tot TS cel kolonies kunnen worden waargenomen, en verander medium met TSC kweekmedium om de cellen te behouden. TSC die EGFP tot expressie brengen (TSC-EGFP) cellijnen werden afgeleid van wild-type TSC’s die werden getransfecteerd met de PB-UBC-EGFP vector door JetPrime (114-15, Polyplus transfectie). TSC’s werden gekweekt bij 37 ° C en 5% CO2 op gegelatineerde en feeder-bedekte weefselkweek graad well plaat en gepasseerd wanneer 80% confluentie is bereikt. Kweekmedium werd dagelijks veranderd.

XENC’s werden afgeleid van E3.5 blastocysten gespoeld uit de baarmoeder van 5-weken oude vrouwelijke 129 muis met behulp van gemodificeerde XENC voorwaarden61. Muis blastocysten werden gekweekt op feeder-cellen totdat ze een uitgroei gevormd op dag 4 die vervolgens werd uitgesplitst door geïncubeerd in 0,1% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten in de incubator. Voeg verse muis ES-cel medium zonder PD0325901 en CHIR99021 om de reactie te stoppen, en vervang het medium om de andere dag tot XEN cel kolonies kunnen worden waargenomen. XEN-cel kolonies werd onderhouden met standaard XEN medium: geavanceerde RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) aangevuld met 15% (v / v) FBS (Gibco) en 0,1 mM β-mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1% penicilline-streptomycine (15140122, Thermo Fisher Scientific). XENC-EGFP cellijn werd rechtstreeks afgeleid van Actin-EGFP muis blastocyst. Voor feeder-vrije cultuur, werden XENCs gehandhaafd op weefselkweek kwaliteit putjes plaat bekleed met gelatine. XEN cellen werden gekweekt bij 37 ° C en 5% CO2. Passaged zodra ze 90% confluentie bereikt. Kweekmedium werd dagelijks veranderd.

Generatie van zelfgeassembleerde embryo’s

ESC’s, die 80% confluentie bereikt, werden eenmaal gewassen met PBS (14190-094, Gibco) en werden geïncubeerd gedurende 5 min bij 37 ° C in TrypLE (12605010, Thermo Fisher Scientific). TSC’s en XENC’s werden gedissocieerd tot afzonderlijke cellen door incubatie met 0,1% trypsine-EDTA (25300054, Thermo Fisher Scientific) bij 37 ° C. Cellen werden gepelletiseerd door centrifugatie bij 1000 rpm gedurende 5 min. De pellet werd opnieuw gesuspendeerd in gereconstrueerd embryo medium door pipetteren tot enkele cellen. De cellen werden automatisch geteld met een geautomatiseerde celteller.

Voor ETX-embryoïden worden ESC’s, TSC’s en XNEC’s gemengd tot een celaantal van respectievelijk 1 × 105, 1 × 105 en 2 × 105 (voor ETS-embryoïden worden ESC’s en TSC’s gemengd tot een celaantal van respectievelijk 1 × 105 en 1 × 105. Voor ETS-embryoïden worden ESC’s en TSC’s gemengd tot een celaantal van respectievelijk 1 × 105 en 1 × 105; voor EXE-embryoïden: meng ESC’s en XENC’s bij een celaantal van respectievelijk 1 × 105 en 1 × 105) met 2 ml gereconstrueerd embryomedium per 35 mm onbehandelde celkweekschaal. Verplaats de schotel op de horizontale rotators bij 37 ° C, 5% CO2, en 100% luchtvochtigheid. De rotatiesnelheid is op 60 rpm per min. De gereconstrueerde embryo medium omvat 39% geavanceerde RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) en 39% DMEM (11960069, Thermo Fisher Scientific) supplement met 17,5% FBS (Gibco, ES-cel gekwalificeerd), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM MEM niet-essentiële aminozuren (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natriumpyruvaat (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicilline-streptomycine (15140122, Thermo Fisher Scientific). Veranderde medium met 2 mL vers gereconstrueerd embryo medium elke dag.

EXE-embryoïden gevormd consistent en efficiënt, kunnen de functionele experimenten worden uitgevoerd zonder selectie van regelmatige of onregelmatige structuren. Voor de functionele experimenten van ETX-embryoïden en ETS-embryoïden, selecteerden we de regelmatige structuren op basis van hun morfologie, en de juiste verhoudingen en posities van ESC en TSC compartimenten door indicatie van TSC-EGFP onder stereofluorescentiemicroscoop.

Wild-type embryo herstel en in vitro cultuur

Blastocysten werden hersteld van E4,5 superovulated zwangere vrouwelijke muizen door spoelen van de baarmoeder met M2 (MR-015-D, Millipore). Culturing embryo’s in IVC medium na verwijdering van de mural trophectoderm in vitro op 8-well μ-Slides (80826, Ibidi)62. Voor het herstel van E5.5, E5.75, en E6.5 embryo’s, dissectie van de decidua van de baarmoeder te beschrijven als het gerapporteerde protocol63. Voor EPI-explantaten van CD1 muizen werden ontleed op dag E5.0 zoals eerder gemeld28 en gekweekt met ETX-embryoïden medium in vitro.

Immunofluorescentie kleuring

Muis embryo’s en gereconstrueerde embryo’s werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde (DingGuo, AR-0211) bij 4 ° C gedurende 20 min en drie keer gewassen met een wasbuffer (PBS met 0,1% Tween-20). Vervolgens werden de embryo’s permeabilized met 0,5% Triton X-100 (H5142, Promega) gedurende 30 min bij kamertemperatuur en werden geïncubeerd met primaire antilichamen in blocking buffer (3% BSA, 0,3% Triton X-100) overnacht bij 4 ° C. Na te zijn gewassen om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen, werden de cellen geïncubeerd met secundaire antilichamen in een blokkeerbuffer gedurende een nacht bij 4 °C. De celkern werd gekleurd met DAPI, gevolgd door tweemaal wassen met wasbuffer, en vervolgens gemonteerd in Fluoroshield Mounting Medium met DAPI (104140, abcam). Beelden werden vastgelegd met een Nikon A1 confocale microscoop.

Imaging met verwerking en analyse

Images voor muis embryo’s en gereconstrueerde embryo’s werden verkregen met behulp van een Nikon A1 confocale microscoop met een 20 × of 40 × objectief. Alle analyses werden uitgevoerd met behulp van open-source beeldanalyse software ” Fiji ”. Weefsel volume en cel nummers voor gereconstrueerde embryo’s en wild-type embryo’s werden geschat en immunofluorescentie intensiteit metingen voor PCX distributie analyse werd ook uitgevoerd met behulp van Fiji software 9.

High-throughput single-cel qPCR en data processing

Voor single-cel isolatie, werden bepaalde cellen in verschillende ontwikkelingsstadia (0, 24, en 84 h) verzameld van twee soorten ETX-embryoïden, die werden gereconstrueerd met Lefty1-mCherry XENC (LC-ETX-embryoïden) en BVSC ESC (BVSC-ETX-embryoïden) reporter cellijnen, respectievelijk. Om de afzonderlijke cellen te isoleren, selecteren we alleen de LC-ETX-embryoïden met DVE/AVE-achtige weefsels geïdentificeerd door asymmetrie expressie van de mCherry-eiwitten, en selecteer de BVSC-ETX-embryoïden met asymmetrie expressie van de mVenus-eiwitten in het ESC-compartiment in de buurt van de grens tussen de ESC- en TSC-compartimenten. Voor LC-ETX-embryoïden werden 0, 24 en 84 h LC-negatieve ESC-afgeleide cellen (LC- XEN) en 84 h positieve ESCs (BVSC+ ES) van de tegenovergestelde zijde van LC- XEN verzameld. Voor BVSC-ETX-embryoïden werden 0, 24 en 84 uur BV-negatieve ESC-afgeleide cellen (BVSC- ES) en 84 uur positieve ESC’s (BVSC+ ES) van de andere kant van BVSC- ES verzameld. Bovendien werden enkele cellen van TSC compartimenten in de ETX-embryoïden geassembleerd met BVSC-ESCs op 0, 24 en 84 h verzameld op basis van EGFP reporter.

Voor single-cel scheiding, werden alle ETX-embryoïden geïncubeerd in 0,1% trypsine-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, USA) gedurende 5 min bij 37 ° C en vervolgens overgebracht in M2 medium (MR-015-D, Millipore). Na enkele malen zachtjes met de mond te zijn gepipetteerd, werden afzonderlijke cellen geïsoleerd met een fijngetrokken glazen tip. Gemiddeld werden 30-40 cellen verzameld voor elk type. Elke cel werd driemaal gewassen in Dulbecco’s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (Invitrogen, Carlsbad, USA) met 0,1% BSA (Sigma-Aldrich, MO, USA), en geplaatst in omgekeerde transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) master mix voor lysis, sequentie-specifieke omgekeerde transcriptie, en pre-amplificatie, zoals beschreven in het vorige verslag64.

Voor het ontwerp en de validatie van primers, genen die cellijndifferentiatie (voornamelijk van E3.5 tot E6.5 stadium) reguleren en deelnemen aan dominante signaleringsroute (bijv, Wnt, Nodal signaalweg) werden geselecteerd, volgens de embryogenese van de muis. De mRNA-sequenties voor elk geïnteresseerd gen werden opgehaald bij NCBI en alleen gemeenschappelijke regio’s werden gebruikt voor genen met verschillende transcripten. Gen-specifieke qRT-primers werden ontworpen met Primer3 software binnen de lengte van 100-250 bp. Alle primers waren getest met cDNA van muizenembryo’s (mengsel van E5,5 en E6,5) voor amplificatie efficiëntie en specificiteit (vermeld in aanvullende gegevens 1).

Single-cel sequentie-specifieke pre-amplificatie vergelijkbaar met eerder rapport65. Een totaal van 96 primer sets werden samengevoegd tot een eindconcentratie van 0,1 uM voor elke primer. Individuele cellen geïsoleerd uit embryo’s werden overgebracht in steriele microbuisjes geladen met 5 pi van RT-PCR master mix met 2,5 pi van CellsDirect reactie mix (Invitrogen, Carlsbad, USA), 0,5 pi van primer zwembad, 0,1 pi van RT / Taq enzym (Invitrogen, Carlsbad, USA), en 1,9 pi van nuclease vrij water (Invitrogen, Carlsbad, USA) in elk buisje. De buisjes werden onmiddellijk bevroren op droog ijs. Na korte centrifugatie bij 4 °C werden de buisjes onmiddellijk in de PCR-machine geplaatst. Cellyses en sequentiespecifieke reverse transcripties werden gedurende 1 uur bij 50 °C uitgevoerd. Daarna werden reverse transcriptase-inactivatie en Taq-polymerase-activering tot stand gebracht door verhitting tot 95 °C gedurende 3 minuten. Vervolgens onderging het cDNA in hetzelfde buisje 20 cycli van sequentiespecifieke amplificatie door denaturering bij 95 °C gedurende 15 s, en annealing en elongatie bij 60 °C gedurende 15 min. Om verdamping te voorkomen, werden de resulterende producten opgeslagen bij -80 ° C.

Voor high-throughput microfluïdische eencellige kwantitatieve PCR, werden alle voorgeamplificeerde cDNA-producten gevalideerd door real-time PCR-systeem (ABI 7500) met endogeen controlegen Actinb, alleen drempelwaarde overschrijding (Ct) binnen 9 tot 12 werden geselecteerd voor verdere experiment. Geamplificeerde eencellige monsters werden geanalyseerd met SsoFast EvaGreen Supermix met lage ROX (Bio-Rad, Californië, USA) en individuele qPCR primers in 96 × 96 dynamische arrays op een Biomark System (Fluidigm, San Francisco, USA). Ct-waarden berekening werden uitgevoerd met de BioMark Real-Time PCR Analysis software (Fluidigm, San Francisco, USA).

Voor Single-Cell Data Processing en Visualization, werden alle ruwe Ct-waarden verkregen uit het BioMark System omgezet in Log2 relatieve expressie niveaus door het aftrekken van de waarden van de veronderstelde achtergrond Ct-waarde van 26. Monsters met lage of afwezige expressie van endogene controlegenen (Actinb en Gapdh) werden van verdere analyse uitgesloten. PLS-DA werd toegepast op de expressiegegevens om celgroepen in verschillende ETX-embryoïden te discrimineren met het R-pakket mixOmics66. Hiërarchische clustering werd uitgevoerd met behulp van Euclidische afstanden, en dendrogrammen werden weergegeven langs de rijen geschaalde heatmaps met behulp van het fluidigmSC pakket. Box-plots en viool plots werden gegenereerd met de oorsprong 8.6 en R software.

BVSC ESC-Chimeric embryo productie

We produceerden de BVSC ESC-Chimeric embryo’s door 8-cel embryo injectie methode door Piezo Micromanipulatie67. Om ervoor te zorgen de gastheer embryo’s werden geïnjecteerd voordat verdichting, verzamelden we de embryo’s in twee-cel stadium en gekweekt in vitro. Om twee-cel stadium embryo’s te verkrijgen, werden 5-weken oude vrouwelijke muizen superovulated door intraperitoneale injectie van vijf internationale eenheden (IE) van PMSG, gevolgd door 5 IE HCG 46-48 uur later, en gedekt met mannelijke muizen. De embryo’s in het tweecellig stadium werden verzameld door het spoelen van de eileider met M2 bij E1,5. Embryo’s werden gewassen in M2 (MR-015-D, Millipore) en vervolgens overgebracht in 10 pi KSOM (MR-020P-5F, Millipore) druppels bedekt met minerale olie op een weefselkweekschaal. De embryo’s werden gehandhaafd bij 37 ° C met 5% CO2 in een incubator.

About 15 ES-cellen werden geïnjecteerd in 8-cel stadium embryo’s door Piezo Micromanipulatie67,68. Acht weken oude CD1 vrouwtjes gepaard met gevasectomiseerde mannetjes werden gebruikt als pseudo-zwangere muizen. Geïnjecteerde blastocysten werden overgebracht in de baarmoeder van pseudo-zwangere vrouwtjes op 2,5 dagen post coitum (dpc). Embryo’s in het morulastadium met geïnjecteerde ESC’s werden overgebracht naar de eileider van 0,5 dpc ontvangers. En we brachten 14-16 embryo’s per ontvanger over. Op E6.5, verzamelden we de chimere embryo’s van deciduae zoals hierboven beschreven.

Embryo transfer en implantatie evaluatie

Echte-weken-oude CD1 vrouwtjes gepaard met gesteriliseerde mannetjes werden gebruikt als pseudo-zwangere muizen. Voor gereconstrueerde embryo’s werden 36 h gereconstrueerde bolletjes (ETX-, ETS-, en EXE-embryoïden) overgebracht in de baarmoederhoornen van pseudo-zwangere ontvangende CD1-vrouwtjesmuizen op 2,5 dpc of 3,5 dpc. Per ontvanger werden zestien tot twintig embryo’s overgebracht. Implantatieplaatsen op dag 6,5 werden geïdentificeerd en geteld door intraveneuze injectie van 100 ul 1% Chicago Sky Blue oplossing. De lengte en straal van elke decidua werd gemeten met behulp van beeldanalyse software, en het volume werd berekend uit deze metingen als V = πr2l.

HE kleuring en immunokleuring van implantatie sites

Om het ontwikkelingspotentieel van zelf-geassembleerde embryo’s te onderzoeken, verzamelden we decidua van verschillende fase, met inbegrip van 48, 72 en 84 uur na de transplantatie. Deze gereconstrueerd (ETX, EXE, en ETS) embryo’s monsters werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde voor overnacht bij 4 ° C, gedehydrateerd met gradiënt alcoholen, overgebracht in xyleen en ingebed in paraffine. We gebruikten E5.5, E6.0, en E6.5 wild-type embryo’s als controle. Monsters werden gesneden tot 5 um dikte, gekleurd met hematoxyline en eosine, en waargenomen onder een microscoop. Deparaffinized gerehydrateerde monsters werden onderworpen aan warmte-geïnduceerde epitoop retrieval in citraatbuffer bij ongeveer 95 ° C door een magnetron gedurende 10 min, na afgekoeld tot kamertemperatuur en tweemaal gespoeld in PBS met 3 min door tweemaal. Permeabilisatie werd uitgevoerd met 0,5% Triton X-100 in PBS gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Na permeabilisatie werden de monsters driemaal gewassen in PBS (telkens 3 min.). Vervolgens werden de monsters geblokkeerd gedurende 30 min met 5% runderserumalbumine (BSA) in PBS en geïncubeerd met primaire antilichamen tegen konijn anti-CK (ab9377, Abcam), konijn anti-COX2 (ab15191, Abcam), konijn anti-Laminine (L9393, Sigma), geit anti-Gata4 (sc-1237, Santa Cruz), of muis anti-PL1 (sc-376436, Santa Cruz) bij 4 ° C gedurende de nacht. De volgende dag, plakjes werden drie keer gewassen in PBS gedurende 5 min en geïncubeerd met secundaire antilichaam gedurende 30 min bij 37 ° C. Secundaire antilichamen werden gelabeld met Alexa Fluorophore 488 of 594 (Invitrogen). Vervolgens werden secties zesmaal gespoeld in PBS met telkens 5 min en gemonteerd met Fluoroshield montage medium met DAPI (ab104140, Abcam). De objectglaasjes werden bewaard bij -20 °C tot ze werden geobserveerd. Beelden werden vastgelegd met een Leica fluorescentiemicroscoop.

In situ hybridisatie

In situ hybridisatie met digoxygenine (DIG) werd uitgevoerd op cryosecties52. Muis-specifieke cRNA probes voor Dtprp werden gebruikt voor hybridisatie. Secties gehybridiseerd met sense probes dienden als negatieve controles. Bevroren secties (8-10 μm) werden geplakt op poly-l-lysine gecoate draagglaasjes (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, China) en bewaard bij -80 °C tot gebruik. Secties werden geplaatst op een dia warmer (37 ° C) gedurende 2 min en vervolgens gerehydrateerd in PBS, post-fixed in 4% PFA gedurende 15 min bij 4 ° C, behandeld met proteinase K (15 ug per ml gedurende 5 min bij kamertemperatuur), 0,25% geacetyleerd gedurende 10 min en gehybridiseerd met DIG gelabelde probes overnacht bij 65 ° C. Twee 65 ° C post-hybridisatie wasbeurten werden uitgevoerd, gevolgd door twee wasbeurten in 1 × MABT, en 30 min RNase behandeling (20 ug per ml) bij 37 ° C. Secties werden geblokkeerd gedurende 1 uur, en ’s nachts geïncubeerd in blok met anti-DIG antilichaam (1:2500, Sigma-Aldrich). Na het wassen werd de kleur ontwikkeld met NBT/BCIP tot een bruin neerslag zichtbaar was. De objectglaasjes werden tegengekleurd met nucleair snelrood, gedehydrateerd en geklaard in xyleen, en gemonteerd in cytoseal montage medium. Foto’s werden genomen onmiddellijk voor het vervagen van de INT / BCIP neerslag optrad.

Genotype identificatie van de overgebrachte zelfgeassembleerde embryo’s

Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit DsRed-ESCs, EGFP-TSCs, en ETX-embryoïden geïsoleerd uit decidua weefsels met behulp van een TIANamp Micro DNA Kit (DP316, Tiangen) volgens de instructies van de fabrikant. De diagnostische primer set EGFP (5ʹ-AGGACGTCATCAAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATAGTCTTCTTCTG-3ʹ) en DsRed (5ʹ-GTGCTTCAGCCGCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCACCTTGATGCCGTTCT-3ʹ) werden gebruikt om de regio van de cellen en de monsters door PCR te identificeren. Het thermische profiel was 95 ° C gedurende 5 min, 35 cycli van 95 ° C gedurende 30 s, 60 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 20 of 40 s, en een laatste cyclus bij 72 ° C gedurende 5 min.

Statistieken

Statistische analyses werden verwerkt op GraphPad Prism 7.0 software (GraphPad Software, La Jolla, CA) voor Windows (met inbegrip van single-cel Log2 expressiegegevens). Gegevens werden gecontroleerd op normale verdeling en gelijke varianties met F-test voordat elke parametrische statistische test werd uitgevoerd. Waar nodig, werden twee-tailed Student’s t-tests uitgevoerd met Welch’s correctie als variantie tussen groepen was niet gelijk. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van s.e.m. of s.d. zoals gespecificeerd. Figuur legenden geven het aantal onafhankelijke experimenten uitgevoerd in elke analyse. Elk experiment werd herhaald voor reproduceerbaarheid.

Weefsel volume (Figs. 1i en 7c, en Supplementary Fig. 4h), percentage en aantal berekening (Figs. 2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m, en 7n; Supplementary Figs. 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a en 12g) werd bepaald met behulp van Excel. De significantie analyse werd uitgevoerd met behulp van t-test door GraphPad Prism. Staafdiagrammen werden getekend door Excel en GraphPad Prism, en scatterplots werden geplot met GraphPad Prism.

Rapportage samenvatting

Meer informatie over de experimentele opzet is beschikbaar in de Nature Research Rapportage samenvatting gekoppeld aan dit artikel.