A community resource

De volledige immunologische dataset van 460 wilde muizen wordt aangeboden als een community resource (Supplementary Data 1). Hieruit vergelijken we in detail een subset van 181 wilde muizen (100 mannelijke, 81 vrouwelijke) van een enkele site (site HW, Fig. 1a, Supplementary Table 1) met 64 in het laboratorium gekweekte, pathogeen-vrije C57BL/6 muizen (24 mannelijke, 40 vrouwelijke). De resultaten van deze vergelijking zijn weergegeven in Tabel 1,2 en Aanvullende Tabel 2, de laatste is te groot om binnen de hoofdtekst van het artikel te passen.

Wilde muizen zijn immunologisch verschillend van laboratoriummuizen

Serologische en morfometrische parameters voor de wilde (HW) en laboratorium (C57/BL6) muizen zijn samengevat in Tabel 1. De wilde muizen waren veel kleiner dan de laboratorium muizen (met een gewicht dat slechts half zo groot was) en bij de wilde muizen waren leeftijd, lichaamslengte en massa allemaal sterk gecorreleerd (lengte en massa, Pearson correlaties (twee-tailed) r=0.79; leeftijd en massa, r≥0.77; leeftijd en lengte, r=0.58, P<0.001, n>80 voor mannelijke en vrouwelijke muizen afzonderlijk) (Supplementary Data 2). De wilde muizen hadden een mediane leeftijd van 6,6 weken (range 1-39,5) en veel immuunparameters correleerden met leeftijd en grootte, waarschijnlijk als gevolg van cumulatieve blootstelling aan infectie (Supplementary Data 2). Van de 62 immunologische maatregelen verschilden de meeste (57 maatregelen) tussen wilde en laboratorium muizen (Tabel 1, Tabel 2, Aanvullende Tabel 2). Bij de wilde muizen waren er zeer weinig (6 van 62 maten) significante immunologische verschillen tussen mannelijke en vrouwelijke muizen, terwijl de laboratoriummuizen meer (18 van 62 maten) immunologisch seksueel dimorf waren (tabel 1, tabel 2, aanvullende tabel 2).

Multilocus genotypering toont aan dat de HW wilde muizen een ongestructureerde, genetisch diverse populatie vormen (Fig. 1b, Aanvullende Gegevens 3). De wilde muizen zijn genetisch verschillend van tien laboratorium muizenstammen, en de laboratorium stammen zijn genetisch meer divers dan de wilde muizen. Wij suggereren dat deze genetische verwantschap tussen de wilde muizen en de laboratoriummuizen wordt verklaard door het mozaïek-genoom van de laboratoriummuizen4 , door het feit dat de laboratoriummuizen gedurende vele generaties opzettelijk van elkaar zijn gescheiden, en door het feit dat de laboratoriumstammen grotendeels homozygoot zijn.

Wilde muizen dragen een aanzienlijke infectiedruk met zich mee

We hebben de wilde muizen gescreend op sporen van infectie met virussen en Mycoplasma pulmonis, en op sporen van ectoparasiet- en intestinale nematode-infectie; leveranciers bevestigden dat de laboratoriummuizen infectievrij waren. De seroprevalentie van de verschillende microbiële infecties varieerde van 22% voor minuscuul virus tot 92% voor parvovirus (n=153 voor beide analyses; supplementaire tabel 3). Wilde muizen waren algemeen geïnfecteerd met de Oxyuride nematode Syphacia spp. (prevalentie 91%) en met de mijt Myocoptes musculinus (prevalentie 82%) (n=181 in beide gevallen). Besmetting van wilde muizen was zeer algemeen: alle wilde muizen waren besmet met ten minste één ziekteverwekker en slechts 5% (8 van 153) was seronegatief voor alle virussen en M. pulmonis. Er was geen effect van geslacht op de intensiteit of prevalentie van infectie (aanvullende tabel 3).

Wilde muizen hebben zeer hoge concentraties serumeiwitten

In wilde muizen waren de serumconcentraties van IgG en IgE respectievelijk 20- en 200-voudiger dan bij de laboratoriummuizen (Fig. 2). Bij de wilde muizen waren de IgE-concentraties significant hoger bij de vrouwtjes dan bij de mannetjes (tabel 1). Daarentegen verschilden de fecale IgA concentraties niet significant tussen de wilde muizen en de laboratorium muizen (Fig. 2, Tabel 1). Wilde muizen hadden ook significant hogere serumconcentraties van de acute-fase-eiwitten, serum amyloid P component (SAP) en haptoglobine dan laboratoriummuizen (Fig. 2, Tabel 1). Deze verschillen waren niet te wijten aan hogere totale serum eiwitconcentraties bij wilde muizen, aangezien de concentraties van alpha-1 antitrypsine (AAT)-een stabiele component van normaal serum- niet verschilden tussen wilde en laboratoriummuizen (Fig. 2, Tabel 1).

Wilde muizen waren heterogener in hun concentraties van immunoglobulinen en acute-fase-eiwitten dan laboratoriummuizen (Fig. 2, Tabel 1, Aanvullende Tabel 4). Hoewel baseline SAP concentraties gedeeltelijk genetisch bepaald zijn13, suggereert de significante correlatie tussen SAP en haptoglobine concentraties (Pearson correlaties (twee-tailed) r=0.41, P<0.0001, r=0.33, P=0.004 voor 96 mannetjes en 77 vrouwtjes, respectievelijk; Supplementary Data 2) dat ontsteking en/of infectie de waarschijnlijke drijfveren zijn van deze heterogeniteit. Bij de wilde muizen waren de serumconcentraties van IgG en IgE significant, positief gecorreleerd met de leeftijd (Pearson correlatie (twee-tailed) r>0.2, P<0.05, n≥79; Supplementary Data 2) waarschijnlijk als gevolg van cumulatieve blootstelling aan infectie. Dit is expliciet te zien voor IgE concentraties die significant positief gecorreleerd waren met het aantal microbiële infecties bij mannelijke wilde muizen (Pearson correlatie (two-tailed) r=0.23, P=0.036, n=80; Supplementary Data 2). Bij vrouwelijke wilde muizen was de fecale IgA-concentratie sterk gecorreleerd met het aantal microbiële infecties en met het aantal mijten (microbiële infecties Pearson correlaties (two-tailed) r=0,58, P<0,0001, n=35; aantal mijten r=-0,380, P=0,01, n=45; Supplementary Data 2).

Wilde muizen splenocyten verschillen van die van laboratoriummuizen

Spleens van wilde muizen waren veel kleiner (ongeveer een derde van de massa) dan die van laboratoriummuizen en bevatten aanzienlijk minder (ongeveer een vijfde van het aantal) levensvatbare mononucleaire leukocyten (tabel 1). Nog verrassender was dat de milten van wilde muizen aanzienlijk proportioneel kleiner waren (dat wil zeggen, in vergelijking met de lichaamsmassa) dan die van laboratoriummuizen (Tabel 1).

Ex vivo flowcytometrische kwantificering en karakterisering van miltcelpopulaties (Figs 3, 4, 5, 6, Supplementary Fig. 1) toonde aan dat de wilde muizen lagere absolute aantallen T-cellen, B-cellen, NK-cellen, dendritische cellen, macrofagen en neutrofielen hadden dan laboratoriummuizen, consistent met hun lagere absolute aantal miltmononucleaire cellen (Supplementary Data 1). Verhoudingsgewijs hadden de milten van wilde muizen echter aanzienlijk meer T-cellen, een hogere T:B-celverhouding en meer CD11b+ myeloïde cellen, maar minder NK-cellen en dendritische cellen dan laboratoriummuizen (aanvullende tabel 2); de verhouding van CD4+: CD8+ T-cellen was ook significant hoger in wilde muizen dan in laboratorium muizen. Deze verschillen zijn consistent met accumulatie van T-helpercellen en fagocytische cellen in de milt van wilde muizen als reactie op systemische infecties.

De status van CD4+ en CD8+ T-cellen was duidelijk verschillend tussen wilde en laboratoriummuizen. Voor CD4+ T cellen waren significant grotere proporties effector/effector geheugen (CD62L- CD44hi) en centraal geheugen (CD62L+ CD44hi) cellen (en dus verhoudingsgewijs minder naïeve, CD62L+ CD44low), in wilde muizen vergeleken met laboratorium muizen (Supplementary Table 2, Fig. 3a). Hoewel de verhoudingen van CD4 + T-cellen die Foxp3 + CD25 + Treg cellen waren marginaal hoger onder wilde dan laboratorium muizen (Supplementary Table 2, Fig. 3b), was dit onvoldoende om de veel grotere proportie van effector CD4 + T-cellen te compenseren, zodat verhoudingen van effector CD4 + T-cellen naar Tregs significant hoger waren onder wilde dan laboratorium muizen (Supplementary Table 2).

Zo ook hadden wilde muizen voor CD8+ T cellen een significant hoger aandeel effector/effector geheugen (CD62L- CD44hi) en terminaal gedifferentieerde (KLRG1+) cellen dan laboratorium muizen (en dus significant lagere proporties naïeve) (Fig. 3c,d). Wilde muizen hadden ook verhoudingsgewijs minder centrale geheugen (CD62L+ CD44hi) CD8+ T cellen dan laboratorium muizen; dit verschil was deels te wijten aan de lage frequentie van deze cellen in wilde mannelijke muizen (supplementaire tabel 2), maar kan ook de relatieve verdeling van antigeen-ervaren CD8+ T cellen tussen de geheugen en effector subsets weerspiegelen. Ook hier was de verhouding tussen effector/effector-geheugen CD8+ T-cellen en Tregs significant hoger in wilde muizen dan in laboratoriummuizen (supplementaire tabel 2).

Consistent met het idee dat frequente of persistente pathogene uitdaging expansie van antigeen-ervaren CD4+ en CD8+ T-cel subsets in wilde muizen stimuleert, waren er significante positieve correlaties tussen de verhoudingen van effector CD4+ en CD8+ T-cellen en leeftijd onder vrouwelijke wilde muizen (Pearson correlaties (twee-tailed) leeftijd en effector CD4+ r=0,62, P<0,0001, n=51; leeftijd en effector CD8+ r=0,49, P<0,0001, n=50; Supplementary Data 2). Interessant is dat deze parameters niet sterk gecorreleerd waren met leeftijd in mannelijke wilde muizen (Pearson correlatie (two-tailed) r<0.1, P>0.05, n=66) wijzend op verschillende immunologische strategieën van mannelijke en vrouwelijke muizen in het wild.

In tegenstelling tot de sterk geprimede/effector status van splenische T cellen, hadden CD19+ B lymfocyten van wilde muizen overwegend een naïef fenotype. We categoriseerden de splenische CD19+ B lymfocyten als naïeve (CD38+ IgD+), geheugen (CD38+ IgD- GL7-) of kiemcentrum (CD38lo IgD- GL7hi) cellen14, en identificeerden recent geactiveerde, antigeen-ervaren cellen door hun MHC klasse II expressie en binding van pinda-agglutinine (PNA; wat wijst op expressie van de PNA-receptor, PNA-R)15 (Fig. 4a). Ondanks hun zeer hoge serum immunoglobuline concentraties, bevatten de milten van wilde muizen significant hogere percentages naïeve B cellen (en, omgekeerd, significant lagere percentages geheugen B cellen) dan de laboratorium muizen (Fig. 4b,c). Deze in eerste instantie contra-intuïtieve observatie weerspiegelt waarschijnlijk de reallocatie van antigeen-ervaren B-cellen van de milt naar het beenmerg, naar andere lymfoïde weefsels, of naar plaatsen van infectie, samen met een voortdurende herbevolking van de milt door naïeve, uit het beenmerg afkomstige B-cellen. Wilde muizen hadden verhoudingsgewijs meer kiemcentrum-B-cellen in hun milt dan laboratoriummuizen en de PNA-binding was verhoudingsgewijs hoger op alle B-celsubgroepen bij wilde muizen, hetgeen consistent is met recente activering15 (Fig. 4d, aanvullende tabel 2). Samen wijzen deze resultaten op een hoge turnover van geactiveerde CD19+ B-cellen in de milt van wilde muizen.

Wilde muizen hebben een tot nu toe onbekende myeloïde celpopulatie

Wij identificeerden vervolgens myeloïde cellen als CD11b+ CD11c- (Fig. 5a) en analyseerden hun expressie van F4/80 en Ly6G, waarbij vier subpopulaties van F4/80+ cellen werden onthuld, aangeduid als M1-M4 (Fig. 5b-d). Deze omvatten F4/80+ Ly6G- (M1) weefsel residente macrofagen, F4/80+ Ly6Glow (M2) monocyten/rode pulp macrofagen en F4/80+/-Ly6Ghigh (M4) polymorphonucleaire cellen (PMN). De M4 PMN populatie kon verder onderverdeeld worden in neutrofielen en myeloïde-afgeleide suppressorcellen gebaseerd op hun voorwaartse en zijdelingse verstrooiingseigenschappen (Fig. 5e). Belangrijk is dat we in wilde muizen, maar niet in laboratoriummuizen, een bijkomende populatie van F4/80+ cellen identificeerden die niveaus van Ly6G tot expressie brengen die het midden houden tussen monocyten/macrofagen en PMN (M3). Voor zover wij weten is dit een nieuwe, nog niet eerder beschreven populatie cellen, die wij hyper-granulocytic myeloid cells (HGMC) hebben genoemd op basis van hun forward en side scatter karakteristieken (Fig. 5c-e). Hoewel er enkele kleine verschillen in niveaus van Ly6G expressie tussen de M2 en M3 / M4 populaties in wilde en laboratoriummuizen (Fig. 5c) back gating van elke populatie op CD11b, CD11c, en forward en side scatter bevestigd dat de M2 populaties in wilde en laboratoriummuizen zijn verder identiek en dat de Ly6Ghigh populatie in laboratoriummuizen is gelijk aan de M4 populatie in wilde muizen (Fig. 5d). Vergelijking van de side scatter voor elke populatie bevestigt ook dat de hoge side scatter, hypergranulocytic M3 populatie inderdaad alleen gezien in wilde muizen (Fig. 5f). De functionele betekenis van deze cellen is nog onbekend, maar hun ontdekking benadrukt dat de studie van laboratoriummuizen niet noodzakelijk het volledige arsenaal van het immuunsysteem onthult.

Wilde muizen hadden niet alleen verhoudingsgewijs meer CD11b+ CD11c- myeloïde cellen in hun milt dan laboratoriummuizen, maar binnen de myeloïde populatie waren PMN en HGMC verrijkt ten koste van macrofagen en monocyten (Fig. 5a,f, Supplementary Table 2). De uitbreiding en/of accumulatie van neutrofielen en HGMC in milten van wilde muizen is consistent met recente of huidige blootstelling aan infectie bij wilde muizen. Splenic CD11c+ dendritische cellen waren verhoudingsgewijs zeldzamer in wilde muizen vergeleken met laboratoriummuizen (Fig. 5g, Supplementary Table 2).

Wilde muis NK cellen zijn zeer geactiveerd

We karakteriseerden NKp46+ CD3ɛ- NK cellen (Fig. 6) als vroege (stadium 1), midden (stadium 2), late (stadium 3) of volledig (stadium 4) rijpe cellen door expressie van CD27 en CD11b (Fig. 6a). Wilde muizen hadden hogere verhoudingen van stadium 1 en stadium 2 cellen en lagere verhoudingen van stadium 3 en stadium 4 splenische NK cellen, resulterend in significant hogere verhoudingen van vroege/middenstadium NK cellen tot late/volwassen NK cellen dan laboratoriummuizen (Fig. 6b, Tabel 2). De expressie van de recente/vroege activeringsmarker CD69 was hoger op alle subsets van NK-cellen van wilde muizen in vergelijking met laboratoriummuizen (Fig. 6c, Tabel 2), maar – behalve op stadium 1 cellen – was de expressie van de KLRG1 terminale differentiatiemarker over het algemeen lager (Fig. 6, Tabel 2). Samen zijn deze gegevens consistent met activering, zelfvernieuwing en homeostatische expansie16 , en dus hogere omloopsnelheden, van splenische NK cellen van wilde muizen vergeleken met laboratoriummuizen.

We onderzochten vervolgens de expressie van de Ly49 familie van C-type lectine regulerende receptoren op NK cellen (Fig. 6e-h) met de redenering dat stochastische expressie van Ly49 receptorfamilieleden op individuele NK-cellen in combinatie met genetische diversiteit van de populatie zou kunnen leiden tot NK-cel heterogeniteit binnen een individu en uitgebreide variatie in NK-celfenotype tussen individuen11. Inhibitoire Ly49-receptoren herkennen zelf-MHC klasse I en verhinderen dat NK-cellen gezonde cellen doden, terwijl Ly49-receptoren die pathogeen-geassocieerde liganden herkennen, leiden tot NK-celactivering en het doden van geïnfecteerde cellen; het best beschreven voorbeeld hiervan is binding van Ly49H aan het murine cytomegalovirus (MCMV) m157 glycoproteïne dat de beschermende immuniteit tegen MCMV medieert (ref. 17).

We analyseerden de expressie van twee activerende receptoren (Ly49D en Ly49H) en één remmende receptor (Ly49G2). Bij de meeste C57BL/6 laboratoriummuizen kwamen de NK-cellen tot expressie met Ly49D, Ly49G en Ly49H (Fig. 6e-h), waarbij 5-45% van de NK-cellen elk van de receptoren tot expressie bracht, hetgeen consistent is met eerdere rapporten18. In tegenstelling hiermee hadden zeer weinig wilde muizen Ly49H+ NK-cellen (10%, n=125, ≥1% van de Ly49H+ cellen, aanvullende gegevens 1), wat suggereert dat het gen dat codeert voor deze receptor zeldzaam is in deze wilde muizenpopulatie of dat allelvariatie herkenning door het anti-Ly49H antilichaam onmogelijk maakt. Wij genotypeerden muizen op de Ly49h locus voor een deletie die wordt geassocieerd met gevoeligheid voor MCMV (ref. 17), en ontdekten dat 18% van de wilde muizen homozygoot was voor deze deletie (95% betrouwbaarheidsinterval 9,5-30%, n=98 muizen van HW site; frequentie van deletie-allel 0,42 uitgaande van Hardy-Weinberg equilibrium). Dit draagt waarschijnlijk gedeeltelijk bij aan de schaarste van Ly49H+ NK cellen onder wilde muizen, maar roept vragen op over de aanwezigheid van additionele null allelen op de Ly49h locus, en of andere receptoren het ontbreken van Ly49H in wilde muizen kunnen compenseren, vooral gezien de hoge prevalentie van MCMV in de wilde muizenpopulaties, waarvan gerapporteerd wordt dat deze 62 en 79% bedraagt (refs 19, 20). De duidelijke afwezigheid van Ly49H bij de wilde muizen kan hun veel frequentere expressie van de alternatieve activerende receptor Ly49D verklaren en suggereert dat er belangrijke verschillen kunnen zijn tussen wilde muizen en laboratoriummuizen in de bijdragen van NK-cellen aan functionele immuniteit.

We identificeerden drie populaties van Ly49G2-cellen: Ly49G2-, Ly49G2low- en Ly49G2high (Fig. 6g). Bij de wilde muizen waren de meeste Ly49G2+ cellen Ly49G2low, terwijl bij de laboratoriummuizen Ly49G2high cellen de overhand hadden. Dit suggereert de aanwezigheid van verschillende allelen op de Ly49G2 coderende locus in de wilde en laboratoriumpopulaties. Bij laboratoriummuizen zijn verschillen tussen de stammen in Ly49G-receptorexpressie in verband gebracht met allelvariatie in promotoractiviteit21 en kunnen ze de drempel voor NK-celactivering beïnvloeden18. Deze gegevens ondersteunen het idee dat er een uitgebreide, tot nu toe niet gedocumenteerde, allelische diversiteit bestaat onder de Ly49 receptoren met waarschijnlijk belangrijke gevolgen voor de NK celfunctie in het wild.

We wilden de balans van expressie van activerende en remmende Ly49 receptoren op NK cellen begrijpen, en dus vergeleken we de proporties NK cellen die wel of niet Ly49D en Ly49G2 tot expressie brachten (Fig. 6e). Wilde muizen hadden significant hogere proporties Ly49D+G- cellen dan laboratoriummuizen, terwijl laboratoriummuizen significant hogere proporties Ly49D-G+ cellen hadden dan wilde muizen (Tabel 2), wat suggereert dat NK cellen van wilde muizen een lagere drempel voor activatie zouden kunnen hebben, hoewel dit sterk zal worden beïnvloed door MHC klasse I genotype en expressie van andere Ly49 receptoren die hier niet zijn onderzocht. Samen tonen deze resultaten aan dat NK cellen van wilde muizen veel gemakkelijker geactiveerd kunnen worden, en dat ook zijn, dan die van laboratoriummuizen, wat een noodzakelijke reactie kan zijn op de hoge pathogenenbelasting van het wilde milieu.

Wilde muizen hebben verminderde cytokine reacties op PAMPs

In het licht van de sterk geactiveerde toestand van het cellulaire immuunsysteem van wilde muizen hebben we de functionele immuunrespons gemeten door splenocyten te kweken in de aanwezigheid van PAMPs (CpG, het ligand voor endosomaal tot expressie gebrachte TLR9; PG, een TLR2 agonist; bacteriële LPS, een ligand voor TLR4) en een mitogeen (monoklonale antilichamen tegen de T-cel oppervlaktemoleculen CD3 en CD28). Bij de 45 vergelijkingen tussen wilde muizen en laboratoriummuizen (5 kweekomstandigheden × 9 cytokinen) werden slechts 16 significante verschillen tussen wilde muizen en laboratoriummuizen waargenomen, en in 13 daarvan waren de analytconcentraties significant lager in de wilde muizen (Fig. 7, aanvullende gegevens 1, aanvullende tabel 5). Van bijzonder belang is dat wilde muizen significant minder IL-12 (p40 en p70) en minder IL-13 produceerden dan laboratoriummuizen in reactie op pathogeen-gerelateerde liganden en er was ook een trend voor IL-10 productie om lager te zijn in wilde muizen, hoewel dit alleen significant was bij baseline. Deze relatief gedaalde cytokine reacties staan in groot contrast met de zeer geactiveerde cellulaire immuunstatus van wilde muizen. Wij speculeren dat een vorm van aangeboren immuuntolerantie de graad van ontsteking kan beperken in chronisch en sterk aan ziekteverwekkers blootgestelde wilde muizen. De enige cytokine responsen die significant hoger waren in wilde muizen dan in laboratorium muizen waren de IFN-γ, IL-4 en MIP-2α responsen op anti-CD3/anti-CD28, wat consistent is met de hogere proporties van geheugen en effector T cellen in wilde muizen. Deze resultaten suggereren dat aangeboren cytokineresponsen, en hun functionele effecten, wellicht opnieuw moeten worden geëvalueerd bij laboratoriummuizen.