Mice

All animal procedures and all of the mouse work were approved by the Animal Care and Use Committee of China Agriculture University (Permit Number: SKLAB-2016-01-04). Os ratos CD1 e 129 foram obtidos do Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Os ratos Actin-GFP foram obtidos do Laboratório Shaorong Gao, na Universidade de Tongji. Todos os ratos foram mantidos em condições específicas livres de patógenos (SPF) com um ciclo 12-h escuro / 12-h claro entre 06:00 e 18:00 em uma sala de temperatura controlada (22 ± 2 °C) com livre acesso a água e alimentos.

Linhas de células-tronco e cultura celular

G4 e G4-ACTB-DsRed-MST ESCs foram obtidos do Dr. Andras Nagy, Kristina Vintersten e Marina Gertsenstein’s Laboratory no Hospital Mount Sinai & do Instituto de Pesquisa Samuel Lunemfeld. Blimp1-mVenus e Stella-ECFP (BVSC) linha de ESC duplos transgênicos, expressando Vênus (mVenus) com membranas-alvo sob o controle de Prdm1 (Blimp1) elementos regulatórios e CFP (ECFP) aperfeiçoados sob o controle de Dppa3 (Stella/Pgc7), foram obtidos do Dr. Mitinori Saitou45,46.

Para a geração da linha de células Lefty1-mCherry mouse XEN, o promotor Lefty1 e a proteína fluorescente foram usados para serem integrados nas células XEN pelo sistema transposon Sleeping Beauty, que consiste em dois componentes: o vetor transposon modificado de pT2/LTR7-GFP (addgene#62541) e o vetor transposase (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879). PT2/LTR7-GFP foi adicionado com castelo “puro”, que podia expressar puromicina N-acetiltransferase e a região CDS GFP foi substituída por mCherry. Fragmento de DNA, que foi amplificado de pT2/LTR7-GFP pelo primer PT2-F (GTTTGGGACAACAACAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACATCATTTTTCTG), acoplado ao castelo “puro” e região CDS mCherry para adquirir o vetor chamado PT2-Puro-mCherry usando NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs). A sequência promotora do gene Lefty1 foi amplificada a partir do DNA das células ES do rato usando Lefty1-F (GTCCGGTGGGGAATCACATT) & R (AAAGGGGTCTTGAGTCTGCGGG). Em seguida, a sequência promotora do gene Lefty1 foi adicionada ao PT2-Puro-mCherry pelo NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs), no qual o PT2-Puro-mCherry foi linearizado pelo EcoRI e a sequência de sobreposição contendo a sequência EcoRI foi adicionada à sequência promotora do gene Lefty1. O vector foi denominado PT2-Puro-mCherry-Lefty1. Então o PT2-Puro-mCherry-Lefty1 e pCMV(CAT)T7-SB100 foram transfectados em células XEN do rato e analisados por 2 μg por mL puromycin para análises subsequentes.

Para a geração de linhas de células knockout Lamc1 (lamina, gama 1), duas sequências de alvos sgRNA (GGAGTACTGCGTGCAGGGGG e GCTTTGCCACCAGGTGGTGTCGGG) foram utilizadas as exon1 de Lamc1 para a construção de um vector duplo sgRNA. Fragmentos contendo duas seqüências de sgRNA amplificadas de PUC-U6-sgRNA-Kana (do laboratório Huang Xingxu) usando primers (Lamc1sg1-F: atgcgtcacacaccaccagtactggcgtgcagttagttagagctagaaatagcaag e Lamc1sg2-R: atgcgtcgtcgaaacacacacacctggtggcaaagcggtgttgtcgtctccccccacaag). O produto PCR foi digerido com BsmbI e ligado com PX330-GFP linearizado. Os Vectores foram transformados em ESCs e XENCs usando Lipofectamina 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific), respectivamente. Em seguida, as células GFP-positivas foram classificadas usando citometria de fluxo e diluídas para crescimento monoclonal. O ADN foi extraído das células monoclonais obtidas e submetido a amplificação e sequenciação por PCR. As células knockout-positivas foram selecionadas para experimentos de seguimento.

Para geração de linhas de células nodais knockout, o exon1 do gRNA (GCCCTCGTCACCGTCCCCTCTGG) Nodal foi utilizado para a construção do vetor sgRNA. Primers para sgRNA Nodal (Nodal-sgF: caccgccctcgtcaccgtcccctc e Nodal-sgR: aaacgaggacgacggtgacgagggc) foram recozidos e o produto recozido foi ligado ao PX330-GFP linearizado pela BbsI. Os vetores foram transformados em ESC usando Lipofectamina 3000 e as células GFP-positivas foram classificadas por citometria de fluxo e diluídas para crescimento monoclonal. O ADN foi extraído das células monoclonais obtidas e submetido a amplificação e sequenciação por PCR. Células knockout-positivas foram selecionadas para experimentos de seguimento.

Para a geração da linha de ESC knockout p53, a sequência sgRNA para a mutação p53 foi clonada no vetor PX330-GFP (addgene, #48138) utilizando o sistema CRISPR-Cas959. O vetor foi transformado em G4 ESCs por Lipofectamina 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Três dias após a transfecção, as células GFP-positivas foram classificadas e plaqueadas em placa de 6 poços. As colônias foram coletadas e as regiões knockout foram amplificadas por PCR usando primers (F: CATCCAGGCGGGAAATAGAGAC; R: CCTGACTGTGTGTAAACTAGGC) e sequenciadas. Alinhando com a sequência do tipo selvagem, foram identificadas colónias de células nocturnas homozigotas e seleccionadas para estudo posterior.

ESCs foram cultivadas em Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) com 15% (v/v) FBS (Gibco, ES cell qualified), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM aminoácidos não essenciais (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM piruvato de sódio (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicilina-estreptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1000 IU LIF (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM PD0325901 (4423, Tocris), e 3 µM CHIR99021 (4192, Tocris). Os ESC foram cultivados a 37°C e 5% de CO2 em placas de poços de cultura de tecidos gelatinizados e cobertos por alimentadores, e passados quando se atinge 80% de confluência.

TSCs foram derivados de E3,5 blastocistos lavados do útero de camundongo CD1 fêmea de 5 semanas15,60. Os blastocistos foram cultivados em células MEF (células alimentadoras) de camundongos mitotópicas inativadas com meio de cultura TSC: RPMI 1640 avançado (11875-093, Thermo Fisher Scientific) suplementado com 20% (v/v) FBS (Gibco, ES qualificado para células), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM piruvato de sódio (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% (v/v) penicilina-estreptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng por mL de recombinante humano FGF4 (235-F4-025, R&D) e 1 µg por mL de heparina (07980, Stem Cell). Até o outgrowth formado no dia 4, eles foram subseqüentemente desagregados por incubação em 0,1% trypsin-EDTA durante 5 min na incubadora. Acrescentar ao substrato fresco de rato 70% de meio embrionário com FGF4 e heparina para parar a reacção e voltar para a incubadora. Substituir o meio dia sim dia não até que se possam observar colónias de células TS, e mudar o meio com meio de cultura TSC para manter as células. As linhas de células TSC expressando EGFP (TSC-EGFP) foram derivadas de TSCs do tipo selvagem que foram transfectadas com o vector PB-UBC-EGFP pelo JetPrime (114-15, transfecção Polyplus). Os TSCs foram cultivados a 37°C e 5% de CO2 em placas de cultura de tecidos gelatinizados e cobertos por alimentadores, e passados quando 80% de confluência é alcançada. O meio de cultura foi alterado diariamente.

XENCs foram derivados de E3,5 blastocistos lavados do útero de uma fêmea de 5 semanas de idade com 129 ratos usando condições XENC modificadas61. Os blastocistos de rato foram cultivados em células de alimentação até formarem um excedente no dia 4 que foi subsequentemente desagregado por incubação em 0,1% de trypsin-EDTA durante 5 min na incubadora. Adicionar o meio de células ES de rato fresco sem PD0325901 e CHIR99021 para parar a reacção, e substituir o meio em dias alternados até que as colónias de células XEN possam ser observadas. As colónias de células XEN foram mantidas com o meio XEN padrão: RPMI avançado 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) suplementado com 15% (v/v) FBS (Gibco) e 0,1 mM β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1% penicilina-estreptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific). A linha de células XENC-EGFP foi derivada diretamente do blastocisto do mouse Actin-EGFP. Para cultura livre de alimentadores, os XENCs foram mantidos em placas de grau de cultura de tecidos bem revestidas com gelatina. As células de XEN foram cultivadas a 37 °C e 5% de CO2. Passaram uma vez que alcançaram 90% de confluência. O meio de cultura foi mudado diariamente.

Geração de embriões auto-montados

ESCs, que alcançaram 80% de confluência, foram lavados uma vez com PBS (14190-094, Gibco) e foram incubados por 5 min a 37 °C em TrypLE (12605010, Thermo Fisher Scientific). TSCs e XENCs foram dissociados para células únicas por incubação com trypsin-EDTA 0,1% (25300054, Thermo Fisher Scientific) a 37 °C. As células foram peletizadas por centrifugação a 1000 rpm durante 5 min. O pellet foi ressuspenso em meio embrionário reconstruído através de pipetagem para células únicas. As células foram contadas automaticamente com o contador automático de células.

Para ETX-embrionóides, misturar ESCs, TSCs e XNECs no número de células de 1 × 105, 1 × 105 e 2 × 105, respectivamente (para ETS-embrionóides, misturar ESCs e TSCs no número de células de 1 × 105 e 1 × 105, respectivamente; para EXE-embrióides, misture ESCs e XENCs em número de células de 1 × 105 e 1 × 105, respectivamente) com 2 mL de meio embrionário reconstruído por prato de cultura de células não tratadas de 35 mm. Mova o prato sobre os rotadores horizontais a 37 °C, 5% de CO2 e 100% de umidade. A taxa de rotação é de 60 rpm por minuto. O meio embrionário reconstruído inclui 39% RPMI 1640 avançado (11875-093, Thermo Fisher Scientific) e 39% DMEM (11960069, Thermo Fisher Scientific) suplemento com 17,5% FBS (Gibco, ES qualificado para células), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM aminoácidos não essenciais (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM piruvato de sódio (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicilina-estreptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific). Meio modificado com 2 mL de meio embrionário fresco reconstruído diariamente.

EMBRIOIDADES EXE formados de forma consistente e eficiente, os experimentos funcionais podem ser realizados sem seleção de estruturas regulares ou irregulares. Para os experimentos funcionais de ETX-embrionóides e ETS-embrionóides, selecionamos as estruturas regulares com base em sua morfologia, e as proporções e posições apropriadas dos compartimentos ESC e TSC por indicação do TSC-EGFP sob microscópio de fluorescência estereoscópica.

Recuperação de embriões tipo selvagem e cultura in vitro

Blastocistos foram recuperados de ratos fêmeas grávidas superovuladas E4,5 por lavagem uterina com M2 (MR-015-D, Millipore). Culturas de embriões em meio IVC após a remoção do trofotoderme mural in vitro em 8-poços μ-Slides (80826, Ibidi)62. Para recuperação dos embriões E5,5, E5,75 e E6,5, a dissecção da decídua do útero é descrita como o protocolo relatado63. Para EPI-explantes de camundongos CD1 foram dissecados no dia E5.0 como previamente relatado28 e cultivados com meio ETX-embrionóides in vitro.

Coloração de imunofluorescência

Embriões de camundongos e embriões reconstruídos foram fixados com paraformaldeído a 4% (DingGuo, AR-0211) a 4°C por 20 min e lavados três vezes com tampão de lavagem (PBS contendo 0,1% de Tween-20). Em seguida, os embriões foram permeabilizados com 0,5% de Triton X-100 (H5142, Promega) durante 30 min à temperatura ambiente e foram incubados com anticorpos primários em tampão de bloqueio (3% BSA, 0,3% Triton X-100) de um dia para o outro a 4 °C. Após serem lavadas para remover anticorpos primários não ligados, as células foram incubadas com anticorpos secundários em tampão bloqueador durante a noite a 4 °C. O núcleo celular foi corado com DAPI, seguido por duas lavagens com tampão de lavagem, depois foram montados em Fluoroshield Mounting Medium com DAPI (104140, abcam). As imagens foram capturadas com um microscópio confocal Nikon A1.

Imagem com processamento e análise

Imagens para embriões de camundongo e embriões reconstruídos foram adquiridos usando um microscópio confocal Nikon A1 com uma objetiva de 20 × ou 40 ×. Todas as análises foram realizadas utilizando um software de análise de imagens de código aberto ”Fiji”. O volume de tecido e o número de células para embriões reconstruídos e embriões do tipo selvagem foram estimados e medições de intensidade de imunofluorescência para análise de distribuição PCX também foram realizadas usando o software Fiji9.

Superior rendimento de células únicas qPCR e processamento de dados

Para isolamento de células únicas, certas células em diferentes estágios de desenvolvimento (0, 24 e 84 h) foram coletadas de dois tipos de ETX-embrionóides, que foram reconstruídos com Lefty1-mCherry XENC (LC-ETX-embryoids) e BVSC ESC (BVSC-ETX-embryoids) linhas de células de reposição, respectivamente. Para isolar as células individuais, selecionamos apenas as LC-ETX-embrióides com tecidos do tipo DVE/AVE identificados pela expressão assimétrica das proteínas mCherry, e selecionamos as BVSC-ETX-embrióides com expressão assimétrica das proteínas mVenus no compartimento ESC próximo à fronteira entre os compartimentos ESC- e TSC. Para LC-ETX-embrionóides, foram coletados 0, 24 e 84 h de células derivadas de ESC negativa (LC- XEN), bem como 84 h de ESC positiva (BVSC+ ES) do lado oposto de LC- XEN. Para BVSC-ETX-embrionóides, foram coletadas células derivadas de ESC negativa (BVSC- ES), 0, 24 e 84 h, bem como 84 h de ESC positiva (BVSC+ ES) do lado oposto de BVSC- ES. Além disso, células únicas de compartimentos TSC nos ETX-embrióides montados com BVSC-ESCs a 0, 24 e 84 h foram coletadas com base no relatório EGFP.

Para a separação de células únicas, todas as ETX-embrióides foram incubadas em trypsin-EDTA 0,1% (Invitrogen, Carlsbad, EUA) por 5 min a 37 °C e então transferidas para o meio M2 (MR-015-D, Millipore). Após várias vezes pipetar suavemente a boca, as células individuais foram isoladas com uma ponta de vidro finamente puxada. Em média, foram recolhidas 30-40 células para cada tipo. Cada célula foi lavada três vezes na solução salina tampão fosfato de Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, EUA) contendo 0,1% de BSA (Sigma-Aldrich, MO, EUA), e colocada em uma mistura mestre de transcrição reversa-polimerase em cadeia (RT-PCR) para lise, transcrição reversa específica da seqüência e pré-amplificação, conforme descrito como relatório anterior64.

Para projeto e validação de primers, genes que regulam a diferenciação da linhagem celular (principalmente do estágio E3,5 a E6,5) e participam do caminho de sinalização dominante (por exemplo Wnt, via de sinalização Nodal) foram selecionados, de acordo com a embriogênese do rato. As seqüências de mRNA para cada gene interessado foram recuperadas do NCBI e apenas regiões comuns foram utilizadas para genes com transcrições diferentes. Os genes específicos qRT-primers foram desenhados com o software Primer3 dentro do comprimento de 100-250 bp. Todos os primers foram testados usando cDNA de embriões de camundongo (mistura de E5.5 e E6.5) para eficiência e especificidade de amplificação (listadas nos Dados Suplementares 1).

Pré-amplificação específica de sequência de células únicas semelhante ao relatório anterior65. Um total de 96 conjuntos de iniciadores foram reunidos para uma concentração final de 0,1 μM para cada iniciador. Células individuais isoladas de embriões foram transferidas para microtubos estéreis carregados com 5 μL de mistura principal RT-PCR contendo 2,5 μL de mistura de reação CellsDirect (Invitrogen, Carlsbad, EUA), 0,5 μL de pool de primer, 0,1 μL de enzima RT/Taq (Invitrogen, Carlsbad, EUA), e 1,9 μL de água livre de nuclease (Invitrogen, Carlsbad, EUA) em cada tubo. Os tubos foram imediatamente congelados em gelo seco. Após breve centrifugação a 4 °C, os tubos foram imediatamente colocados em máquina de PCR. Foram realizadas transcrições invertidas de lisos celulares e sequências específicas a 50 °C durante 1 h. Posteriormente, a inactivação da transcriptase inversa e a activação da polimerase Taq foram obtidas através do aquecimento a 95 °C durante 3 min. Subsequentemente, no mesmo tubo, o cDNA passou por 20 ciclos de amplificação específica da sequência, desnaturalizando a 95 °C durante 15 s, e recozimento e alongamento a 60 °C durante 15 min. Para evitar a evaporação, os produtos resultantes foram armazenados a -80 °C.

Para a PCR quantitativa de células únicas microfluídicas de alto rendimento, todos os produtos pré-amplificados de cDNA foram validados pelo sistema de PCR em tempo real (ABI 7500) usando o gene de controlo endógeno Actinb, apenas o valor de cruzamento de limiar (Ct) entre 9 e 12 foram seleccionados para o experimento subsequente. Amostras amplificadas de célula única foram analisadas com SsoFast EvaGreen Supermix com Low ROX (Bio-Rad, Califórnia, EUA) e primers individuais qPCR em matrizes dinâmicas 96 × 96 em um sistema Biomark (Fluidigm, São Francisco, EUA). O cálculo dos valores Ct foram realizados com o software BioMark Real-Time PCR Analysis (Fluidigm, San Francisco, EUA).

Para Processamento e Visualização de Dados de uma única célula, todos os valores Ct brutos obtidos do BioMark System foram convertidos em níveis de expressão relativa Log2 subtraindo os valores do valor Ct de fundo assumido de 26. As amostras com expressão baixa ou ausente dos genes de controle endógeno (Actinb e Gapdh) foram excluídas da análise subseqüente. PLS-DA foi aplicado aos dados de expressão para discriminar grupos de células em diferentes ETX-embrionóides com pacote R mixOmics66. O agrupamento hierárquico foi realizado usando distâncias Euclidianas, e os dendrogramas foram exibidos ao longo dos heatmaps em escala de linha usando o pacote fluidigmSC. Box-plots e gráficos de violino foram gerados com o software de origem 8.6 e R.

BVSC ESC-Chimeric embryo production

Produzimos os embriões BVSC ESC-Chimeric por método de injeção de embriões de 8 células por Piezo Micromanipulation67. Para garantir que os embriões hospedeiro fossem injetados antes da compactação, coletamos os embriões em estágio de duas células e cultivados in vitro. Para obter embriões em estágio de duas células, ratos fêmeas de 5 semanas foram superovulados por injeção intraperitoneal de cinco unidades internacionais (IU) de PMSG, seguidas por 5 IU HCG 46-48 h mais tarde, e acasalados com ratos machos. Embriões de duas células foram coletados através da lavagem do oviduto com M2 na E1.5. Os embriões foram lavados em M2 (MR-015-D, Millipore) e depois transferidos para 10 μL KSOM (MR-020P-5F, Millipore) gotas cobertas com óleo mineral em um prato de cultura de tecidos. Os embriões foram mantidos a 37 °C com 5% de CO2 em uma incubadora.

Sobre 15 células ES foram injetadas em embriões em estágio de 8 células por Piezo Micromanipulação67,68. Foram utilizadas fêmeas CD1 com 8 semanas de idade acasaladas com machos vasectomizados como ratos pseudográvidas. Blastocistos injetados foram transferidos para o útero de fêmeas pseudoprenhes com 2,5 dias pós coito (dpc). Embriões na fase de mórula com ESC injetada foram transferidos para o oviduto dos receptores de 0,5 dpc. E nós transferimos 14-16 embriões por receptora. Na E6.5, coletamos os embriões quiméricos de decíduas como descrito acima.

Transferência embrionária e avaliação de implantação

Fêmeas CD1 com 8 semanas de idade acasaladas com vasectomizado masculino foram utilizadas como ratos pseudográvidas. Para embriões reconstruídos, 36 h de esferas reconstruídas (ETX-, ETS- e EXE-embrionóides) foram transferidas para os cornos uterinos de ratos CD1 receptores pseudoprenhes a 2,5 dpc ou 3,5 dpc. Dezesseis a vinte embriões foram transferidos por receptor. Os locais de implantação no dia 6,5 foram identificados e contados por injeção intravenosa de 100 μL 1% de solução Chicago Sky Blue. O comprimento e raio de cada decídua foi medido usando um software de análise de imagem, e o volume foi calculado a partir destas medidas como V = πr2l.

He coloração e imunosstaining dos locais de implantação

Para examinar o potencial de desenvolvimento de embriões auto-montados, coletamos decídua de diversos estágios, incluindo 48, 72, e 84 h após o transplante. Essas amostras de embriões reconstruídos (ETX, EXE e ETS) foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 °C, desidratadas com álcoois gradientes, transferidas para xileno e embutidas em parafina. Utilizámos como controlo embriões do tipo selvagem E5.5, E6.0, e E6.5. As amostras foram fatiadas a 5 μm de espessura, coradas com hematoxilina e eosina, e observadas sob microscópio. Amostras reidratadas e desidratadas foram submetidas à recuperação de epitopos induzidos pelo calor em tampão citrato a cerca de 95 °C por um forno de microondas durante 10 min, após resfriadas à temperatura ambiente e enxaguadas duas vezes em PBS com 3 min por duas vezes. A permeabilização foi realizada com 0,5% de Triton X-100 em PBS durante 20 min à temperatura ambiente. Após a permeabilização, as amostras foram lavadas em PBS durante três vezes (3 min cada). Em seguida, as amostras foram bloqueadas por 30 min com 5% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS e incubadas com anticorpos primários contra Coelho anti-CK (ab9377, Abcam), Coelho anti-COX2 (ab15191, Abcam), Coelho anti-Laminina (L9393, Sigma), Cabra anti-Gata4 (sc-1237, Santa Cruz), ou Rato anti-PL1 (sc-376436, Santa Cruz) a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, as fatias foram lavadas três vezes em PBS durante 5 min e incubadas com anticorpos secundários durante 30 min a 37 °C. Os anticorpos secundários foram rotulados com Alexa Fluorophore 488 ou 594 (Invitrogen). Posteriormente, os cortes foram enxaguados seis vezes em PBS com 5 min cada e montados com Fluoroshield com DAPI (ab104140, Abcam). As lâminas foram mantidas a -20 °C até serem observadas. As imagens foram capturadas com um microscópio fluorescente Leica.

Hibridação in situ

Hibridação in situ com digoxigenina (DIG) foi realizada em criosseções52. Para a hibridação foram utilizadas sondas de cRNA específicas para ratos para Dtprp. Seções hibridizadas com sondas de sentido serviram como controles negativos. As secções congeladas (8-10 μm) foram aderidas a lâminas revestidas com poli-l-lisina (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, China) e armazenadas a -80 °C até serem utilizadas. As seções foram colocadas em um aquecedor de lâminas (37 °C) por 2 min e depois reidratadas em PBS, pós-fixadas em 4% PFA por 15 min a 4 °C, tratadas com proteinase K (15 μg por mL por 5 min à temperatura ambiente), 0,25% acetiladas por 10 min e hibridizadas com sondas marcadas com DIG durante a noite a 65 °C. Foram realizadas duas lavagens pós-hibridização a 65 °C, seguidas de duas lavagens em 1 × MABT, e 30 min de tratamento com RNase (20 μg por mL) a 37 °C. As secções foram bloqueadas durante 1 h, e incubadas durante a noite em bloco com anticorpos anti-DIG (1:2500, Sigma-Aldrich). Após a lavagem, a cor foi desenvolvida usando NBT/BCIP até que um precipitado marrom fosse visível. As lâminas foram contra-manchadas com vermelho rápido nuclear, desidratadas e limpas em xileno, e montadas em meio de montagem citoseal. Fotografias foram tiradas imediatamente antes do desbotamento do precipitado INT/BCIP.

Identificação genotípica dos embriões auto-montados transferidos

DNA genômico foi extraído de DsRed-ESCs, EGFP-TSCs e ETX-embrionóides isolados de tecidos decídua usando um TIANamp Micro DNA Kit (DP316, Tiangen) de acordo com as instruções do fabricante. O conjunto de primers de diagnóstico EGFP (5ʹ-AGGGACGTCATCAAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATAGTCTTCTTCTG-3ʹ) e DsRed (5ʹ-GTGCTTCAGCCGCCGCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCACCTTGATGCCGTTTCT-3ʹ) foram utilizados para identificar a região das células e as amostras por PCR. O perfil térmico foi de 95 °C durante 5 min, 35 ciclos de 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s e 72 °C durante 20 ou 40 s, e um ciclo final a 72 °C durante 5 min.

Estatística

Análises estatísticas foram processadas no software GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA) para Windows (incluindo dados de expressão Log2 de uma única célula). Os dados tinham sido verificados para uma distribuição normal e variâncias iguais com o teste F antes de cada teste estatístico paramétrico ser realizado. Quando apropriado, os testes t de Student de duas caudas foram realizados com correção de Welch se a variância entre os grupos não foi igual. As barras de erro representam o erro padrão de s.e.m ou s.d., conforme especificado. As legendas das figuras indicam o número de experimentos independentes realizados em cada análise. Cada experimento foi repetido para reprodutibilidade.

Volume do tecido (Figs. 1i e 7c, e Suplementar Fig. 4h), cálculo de porcentagem e número (Figs. 2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m, e 7n; Suplementar Figs. 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a e 12g) foi determinado usando o Excel. A análise de significância foi realizada utilizando o teste t do Prisma GraphPad. Os gráficos de barra foram desenhados pelo Excel e GraphPad Prism, e os gráficos de dispersão foram traçados usando GraphPad Prism.

Reporting summary

Outras informações sobre o desenho experimental estão disponíveis no Nature Research Reporting Summary ligado a este artigo.