O resursă comunitară

Setul complet de date imunologice a 460 de șoareci sălbatici este furnizat ca resursă comunitară (Date suplimentare 1). Din acesta, comparăm în detaliu un subset de 181 de șoareci sălbatici (100 de masculi, 81 de femele) dintr-un singur sit (situl HW, Fig. 1a, Tabelul suplimentar 1) cu 64 de șoareci C57BL/6 (24 de masculi, 40 de femele) crescuți în laborator, fără agenți patogeni. Rezultatele acestei comparații sunt prezentate în tabelele 1,2 și în tabelul suplimentar 2, acesta din urmă fiind prea mare pentru a încăpea în textul principal al articolului.

Șoarecii sălbatici sunt diferiți din punct de vedere imunologic de șoarecii de laborator

Parametrii serologici și morfometrici pentru șoarecii sălbatici (HW) și cei de laborator (C57/BL6) sunt rezumați în tabelul 1. Șoarecii sălbatici au fost mult mai mici decât șoarecii de laborator (cântărind doar pe jumătate), iar în rândul șoarecilor sălbatici, vârsta, lungimea corpului și masa au fost toate foarte corelate (lungime și masă, corelații Pearson (cu două cozi) r=0,79; vârstă și masă, r≥0,77; vârstă și lungime, r=0,58, P<0,001, n>80 pentru șoareci masculi și femele separat) (Date suplimentare 2). Șoarecii sălbatici au avut o vârstă mediană de 6,6 săptămâni (interval 1-39,5) și mulți parametri imunitari s-au corelat cu vârsta și dimensiunea, probabil din cauza expunerii cumulative la infecție (Date suplimentare 2). Din 62 de măsuri imunologice, cele mai multe (57 de măsuri) au fost diferite între șoarecii sălbatici și cei de laborator (tabelul 1, tabelul 2, tabelul suplimentar 2). În rândul șoarecilor sălbatici au existat foarte puține (6 din 62 de măsuri) diferențe imunologice semnificative între șoarecii masculi și femele, în timp ce șoarecii de laborator au fost mai mulți (18 din 62 de măsuri) dimorfi din punct de vedere imunologic din punct de vedere sexual (Tabelul 1, Tabelul 2, Tabelul suplimentar 2).

Genotiparea multilocus arată că șoarecii sălbatici HW sunt o populație nestructurată, diversă din punct de vedere genetic (Fig. 1b, Date suplimentare 3). Șoarecii sălbatici sunt diferiți din punct de vedere genetic de zece tulpini de șoareci de laborator, iar tulpinile de laborator sunt mai diverse din punct de vedere genetic decât șoarecii sălbatici. Sugerăm că această relație genetică dintre șoarecii sălbatici și șoarecii de laborator se explică prin mozaicarea genomului șoarecilor de laborator4, prin faptul că șoarecii de laborator au fost separați în mod deliberat unii de alții timp de mai multe generații și prin faptul că tulpinile de laborator sunt în mare parte homozigote.

Șoarecii sălbatici poartă o povară substanțială de infecții

Am analizat șoarecii sălbatici pentru a găsi dovezi de infecție cu virusuri și Mycoplasma pulmonis, precum și dovezi de infecție cu ectoparaziți și nematozi intestinali; furnizorii au confirmat că șoarecii de laborator nu prezintă infecții. Seroprevalența diferitelor infecții microbiene a variat de la 22 % pentru virusul minutei la 92 % pentru parvovirus (n=153 pentru ambele analize; tabelul suplimentar 3). Șoarecii sălbatici au fost frecvent infectați cu nematodul Oxyurid Syphacia spp. (prevalență de 91%) și cu acarianul Myocoptes musculinus (prevalență de 82%) (n=181 în ambele cazuri). Infecția șoarecilor sălbatici a fost foarte frecventă: toți șoarecii sălbatici au fost infectați cu cel puțin un agent patogen și doar 5% (8 din 153) au fost seronegativi pentru toate virusurile și M. pulmonis. Nu a existat niciun efect al sexului asupra intensității sau prevalenței infecției (tabelul suplimentar 3).

Șoarecii sălbatici au concentrații foarte mari de proteine serice

La șoarecii sălbatici, concentrațiile serice de IgG și IgE au fost de 20 și, respectiv, de 200 de ori mai mari la șoarecii sălbatici decât la șoarecii de laborator (Fig. 2). În rândul șoarecilor sălbatici, concentrațiile de IgE au fost semnificativ mai mari în rândul femelelor decât în rândul masculilor (tabelul 1). În schimb, concentrațiile de IgA în fecale nu au fost semnificativ diferite între șoarecii sălbatici și cei de laborator (Fig. 2, Tabelul 1). Șoarecii sălbatici au avut, de asemenea, concentrații serice semnificativ mai mari ale proteinelor de fază acută, ale componentei amiloide P serice (SAP) și ale haptoglobinei decât șoarecii de laborator (Fig. 2, Tabelul 1). Aceste diferențe nu s-au datorat unor concentrații mai mari de proteine serice totale la șoarecii sălbatici, deoarece concentrațiile de alfa-1 antitripsină (AAT) – o componentă stabilă a serului normal – nu au fost diferite între șoarecii sălbatici și cei de laborator (Fig. 2, Tabelul 1).

Șoarecii sălbatici au fost mai eterogeni în ceea ce privește concentrațiile de imunoglobuline și proteine de fază acută în comparație cu șoarecii de laborator (Fig. 2, tabelul 1, tabelul suplimentar 4). Deși concentrațiile inițiale de SAP sunt parțial determinate genetic13, corelația semnificativă dintre concentrațiile de SAP și haptoglobină (corelații Pearson (cu două cozi) r=0,41, P<0,0001, r=0,33, P=0,004 pentru 96 de masculi și, respectiv, 77 de femele; Date suplimentare 2) sugerează că inflamația și/sau infecția sunt factorii probabili ai acestei eterogenități. În rândul șoarecilor sălbatici, concentrațiile serice de IgG și IgE au fost corelate semnificativ, pozitiv, cu vârsta (corelația Pearson (cu două cozi) r>0,2, P<0,05, n≥79; Date suplimentare 2), reflectând probabil expunerea cumulativă la infecție. Acest lucru poate fi observat în mod explicit pentru concentrațiile de IgE, care au fost corelate în mod semnificativ și pozitiv cu numărul de infecții microbiene la șoarecii sălbatici masculi (corelație Pearson (cu două cozi) r=0,23, P=0,036, n=80; Date suplimentare 2). La femelele de șoareci sălbatici, concentrația de IgA în fecale a fost puternic corelată cu numărul de infecții microbiene și cu numărul de acarieni (corelații Pearson pentru infecții microbiene (cu două cozi) r=0,58, P<0,0001, n=35; numărul de acarieni r=-0,380, P=0,01, n=45; Date suplimentare 2).

Splenocitele șoarecilor sălbatici diferă de cele ale șoarecilor de laborator

Splenele șoarecilor sălbatici erau mult mai mici (aproximativ o treime din masă) decât cele ale șoarecilor de laborator și conțineau semnificativ mai puține leucocite mononucleare viabile (aproximativ o cincime din număr) (tabelul 1). Mai surprinzător, splina șoarecilor sălbatici a fost semnificativ mai mică în mod proporțional (adică în comparație cu masa corporală) decât cea a șoarecilor de laborator (tabelul 1).

Cantificarea și caracterizarea prin citometrie în flux ex vivo a populațiilor de celule din splină (figurile 3, 4, 5, 6, fig. supliment. 1) a arătat că șoarecii sălbatici aveau un număr absolut mai mic de celule T, celule B, celule NK, celule dendritice, macrofage și neutrofile decât șoarecii de laborator, în concordanță cu numărul lor absolut mai mic de celule mononucleare splenice (Date suplimentare 1). Dar, proporțional, splina șoarecilor sălbatici avea semnificativ mai multe celule T, un raport T:celule B mai mare și mai multe celule mieloide CD11b+, dar mai puține celule NK și celule dendritice, decât șoarecii de laborator (Tabelul suplimentar 2); raportul dintre CD4+: CD8+ celule T a fost, de asemenea, semnificativ mai mare la șoarecii sălbatici decât la șoarecii de laborator. Aceste diferențe sunt în concordanță cu acumularea de celule T helper și de celule fagocitare în splina șoarecilor sălbatici ca răspuns la infecțiile sistemice.

Starea celulelor T CD4+ și CD8+ a fost semnificativ diferită între șoarecii sălbatici și cei de laborator. În ceea ce privește celulele T CD4+, proporții semnificativ mai mari de celule de memorie efectoare/efectoare (CD62L- CD44hi) și de memorie centrală (CD62L+ CD44hi) (și deci proporțional mai puține celule naive, CD62L+ CD44low), la șoarecii sălbatici în comparație cu șoarecii de laborator (tabelul suplimentar 2, figura 3a). Deși proporțiile de celule T CD4+ care erau celule Treg Foxp3+ CD25+ au fost marginal mai mari la șoarecii sălbatici decât la cei de laborator (tabelul suplimentar 2, figura 3b), acest lucru a fost insuficient pentru a compensa proporția mult mai mare de celule T CD4+ efectoare, astfel încât raportul dintre celulele T CD4+ efectoare și Tregs a fost semnificativ mai mare la șoarecii sălbatici decât la cei de laborator (tabelul suplimentar 2).

În mod similar, pentru celulele T CD8+, șoarecii sălbatici au avut o proporție semnificativ mai mare de celule efectoare/efectoare de memorie (CD62L- CD44hi) și de celule diferențiate terminal (KLRG1+) decât șoarecii de laborator (și astfel proporții semnificativ mai mici de celule naive) (Fig. 3c,d). Șoarecii sălbatici au avut, de asemenea, proporțional mai puține celule T CD8+ CD8+ cu memorie centrală (CD62L+ CD44hi) decât șoarecii de laborator; această diferență s-a datorat în parte frecvenței scăzute a acestor celule la șoarecii masculi sălbatici (tabelul suplimentar 2), dar poate reflecta, de asemenea, distribuția relativă a celulelor T CD8+ cu experiență antigenică între subseturile de memorie și efector. Din nou, raportul dintre celulele T CD8+ cu memorie efectoare/efectoare și Tregs a fost semnificativ mai mare la șoarecii sălbatici decât la cei de laborator (tabelul suplimentar 2).

Consecvent cu ideea că provocarea frecventă sau persistentă a agenților patogeni determină expansiunea subseturilor de celule T CD4+ și CD8+ cu experiență antigenică la șoarecii sălbatici, au existat corelații pozitive semnificative între proporțiile de celule T CD4+ și CD8+ efectoare și vârsta în rândul șoarecilor sălbatici femele (corelații Pearson (cu două cozi) vârstă și CD4+ efectoare r=0,62, P<0,0001, n=51; vârsta și efectorul CD8+ r=0,49, P<0,0001, n=50; Date suplimentare 2). În mod interesant, acești parametri nu au fost puternic corelați cu vârsta la șoarecii sălbatici masculi (corelație Pearson (cu două cozi) r<0,1, P>0,05, n=66), ceea ce indică strategii imunologice diferite ale șoarecilor masculi și femele în sălbăticie.

În contrast cu statutul foarte bine amorsat/efector al celulelor T splenice, limfocitele B CD19+ ale șoarecilor sălbatici au avut predominant un fenotip naiv. Am clasificat limfocitele B CD19+ splenice în celule naive (CD38+ IgD+), de memorie (CD38+ IgD- GL7-) sau de centru germinal (CD38lo IgD- GL7hi)14 și am identificat celulele recent activate, cu experiență antigenică, prin expresia MHC clasa II și legarea aglutininei de arahide (PNA; indicând expresia receptorului PNA, PNA-R)15 (Fig. 4a). În ciuda concentrațiilor foarte ridicate de imunoglobuline serice, splina șoarecilor sălbatici conținea proporții semnificativ mai mari de celule B naive (și, reciproc, proporții semnificativ mai mici de celule B cu memorie) decât șoarecii de laborator (Fig. 4b,c). Această observație inițial contraintuitivă reflectă probabil realocarea celulelor B cu experiență antigenică din splină în măduva osoasă, în alte țesuturi limfoide sau în focarele de infecție, împreună cu repopularea continuă a splinei cu celule B naive, derivate din măduva osoasă. Șoarecii sălbatici au avut proporțional mai multe celule B din centrul germinativ în splină decât șoarecii de laborator, iar legarea PNA a fost comparativ mai mare pe toate subseturile de celule B la șoarecii sălbatici, în concordanță cu o activare recentă15 (Fig. 4d, tabelul suplimentar 2). Împreună, aceste rezultate indică o rotație ridicată a celulelor B CD19+ activate în splina șoarecilor sălbatici.

Șoarecii sălbatici au o populație de celule mieloide necunoscută până în prezent

Am identificat în continuare celulele mieloide ca fiind CD11b+ CD11c- (Fig. 5a) și am analizat expresia lor de F4/80 și Ly6G, dezvăluind patru subpopulații de celule F4/80+, denumite M1-M4 (Fig. 5b-d). Acestea includ F4/80+ Ly6G- (M1) macrofage rezidente în țesut, F4/80+ Ly6Glow (M2) monocite/microfage de pulpă roșie și F4/80+/-Ly6Ghigh (M4) celule polimorfonucleare (PMN). Populația M4 PMN a putut fi împărțită în continuare în neutrofile și celule supresoare derivate din mieloide pe baza caracteristicilor lor de dispersie înainte și laterală (Fig. 5e). În mod important, la șoarecii sălbatici, dar nu și la cei de laborator, am identificat o populație suplimentară de celule F4/80+ care exprimă niveluri de Ly6G care sunt intermediare între monocite/macrofage și PMN (M3). Din câte știm, aceasta este o nouă populație de celule care nu a fost descrisă anterior, pe care am denumit-o celule mieloide hipergranulocitare (HGMC) pe baza caracteristicilor lor de dispersie înainte și laterală (Fig. 5c-e). Deși există unele diferențe ușoare în ceea ce privește nivelurile de expresie Ly6G între populațiile M2 și M3/M4 la șoarecii sălbatici și cei de laborator (Fig. 5c), o analiză retrospectivă a fiecărei populații pe baza CD11b, CD11c și a dispersiei frontale și laterale a confirmat faptul că populațiile M2 la șoarecii sălbatici și de laborator sunt identice și că populația cu nivel ridicat de Ly6G la șoarecii de laborator este echivalentă cu populația M4 la șoarecii sălbatici (Fig. 5d). Compararea dispersiei laterale pentru fiecare populație confirmă, de asemenea, faptul că populația M3 hipergranulocitară cu dispersie laterală ridicată este într-adevăr observată numai la șoarecii sălbatici (Fig. 5f). Semnificația funcțională a acestor celule este încă necunoscută, dar descoperirea lor subliniază faptul că studiul șoarecilor de laborator nu dezvăluie neapărat întregul armament al sistemului imunitar.

Șoarecii sălbatici nu numai că aveau proporțional mai multe celule mieloide CD11b+ CD11c- în splină decât șoarecii de laborator, dar, în cadrul populației mieloide, PMN și HGMC au fost îmbogățite în detrimentul macrofagelor și monocitelor (Fig. 5a,f, Tabelul suplimentar 2). Extinderea și/sau acumularea de neutrofile și HGMC în splina șoarecilor sălbatici este în concordanță cu expunerea recentă sau curentă la infecție la șoarecii sălbatici. Celulele dendritice CD11c+ splenice au fost proporțional mai rare la șoarecii sălbatici în comparație cu șoarecii de laborator (Fig. 5g, Tabelul suplimentar 2).

Celele NK ale șoarecilor sălbatici sunt puternic activate

Am caracterizat celulele NK NKp46+ CD3ɛ- (Fig. 6) ca fiind celule mature timpurii (stadiul 1), medii (stadiul 2), târzii (stadiul 3) sau complet (stadiul 4) prin exprimarea CD27 și CD11b (Fig. 6a). Șoarecii sălbatici au avut proporții mai mari de celule în stadiile 1 și 2 și proporții mai mici de celule NK splenice în stadiile 3 și 4, ceea ce a dus la un raport semnificativ mai mare de celule NK timpurii/în stadiu mediu față de celulele NK târzii/mature decât șoarecii de laborator (Fig. 6b, tabelul 2). Expresia markerului de activare recentă/încipientă CD69 a fost mai mare pe toate subseturile de celule NK de șoarece sălbatic în comparație cu șoarecii de laborator (Fig. 6c, tabelul 2), dar – în afară de celulele din stadiul 1 – expresia markerului de diferențiere terminală KLRG1 a avut tendința de a fi mai mică (Fig. 6, tabelul 2). Împreună, aceste date sunt în concordanță cu activarea, auto-reînnoirea și expansiunea homeostatică16 și, prin urmare, cu rate mai mari de reînnoire, a celulelor NK splenice ale șoarecilor sălbatici în comparație cu șoarecii de laborator.

Am explorat apoi expresia familiei Ly49 de receptori de reglementare a lectinei de tip C pe celulele NK (Fig. 6e-h), motivând că expresia stocastică a membrilor familiei de receptori Ly49 pe celulele NK individuale, combinată cu diversitatea genetică a populației, ar putea duce la eterogenitatea celulelor NK în cadrul unui individ și la o variație extinsă a fenotipului celulelor NK între indivizi11. Receptorii Ly49 inhibitori recunosc auto-MHC clasa I și împiedică celulele NK să ucidă celulele sănătoase, în timp ce receptorii Ly49 care recunosc liganzii asociați agenților patogeni conduc la activarea celulelor NK și la uciderea celulelor infectate; cel mai bine descris exemplu în acest sens este legarea Ly49H la glicoproteina m157 a citomegalovirusului murin (MCMV), care mediază imunitatea protectoare la MCMV (ref. 17).

Am analizat expresia a doi receptori activatori (Ly49D și Ly49H) și a unui receptor inhibitor (Ly49G2). Pentru majoritatea șoarecilor de laborator C57BL/6, celulele NK au exprimat Ly49D, Ly49G și Ly49H (Fig. 6e-h), cu 5-45% din celulele NK exprimând fiecare dintre receptori, în concordanță cu rapoartele anterioare18. În schimb, foarte puțini șoareci sălbatici au avut celule NK Ly49H+ (10%, n=125, ≥1% din celulele Ly49H+, Date suplimentare 1), sugerând că gena care codifică acest receptor este rară în această populație de șoareci sălbatici sau că variația alelică împiedică recunoașterea de către anticorpul anti-Ly49H. Am genotipat șoarecii la nivelul locusului Ly49h pentru o deleție care este asociată cu sensibilitatea la MCMV (ref. 17), constatând că 18 % dintre șoarecii sălbatici erau homozigoți pentru această deleție (interval de încredere de 95 % 9,5-30 %, n=98 de șoareci din situl HW; frecvența alelei de deleție 0,42, presupunând un echilibru Hardy-Weinberg). Probabil că acest lucru contribuie parțial la raritatea celulelor NK Ly49H+ în rândul șoarecilor sălbatici, dar ridică întrebări cu privire la prezența unor alte alele nulale la nivelul locusului Ly49h și dacă alți receptori pot compensa lipsa Ly49H la șoarecii sălbatici, mai ales având în vedere prevalența ridicată a MCMV în populațiile de șoareci sălbatici, raportată a fi de 62 și 79 % (ref. 19, 20). Absența aparentă a Ly49H în rândul șoarecilor sălbatici poate explica expresia mult mai frecventă a receptorului activator alternativ Ly49D și sugerează că pot exista diferențe importante între șoarecii sălbatici și cei de laborator în ceea ce privește contribuțiile celulelor NK la imunitatea funcțională.

Am identificat trei populații de celule Ly49G2: Ly49G2-, Ly49G2low și Ly49G2high (Fig. 6g). În rândul șoarecilor sălbatici, majoritatea celulelor Ly49G2+ au fost Ly49G2low, în timp ce la șoarecii de laborator au predominat celulele Ly49G2high. Acest lucru sugerează prezența unor alele diferite la nivelul locusului codificator Ly49G2 în populațiile sălbatice și de laborator. În rândul șoarecilor de laborator, diferențele dintre tulpini în ceea ce privește expresia receptorului Ly49G au fost legate de variația alelică a activității promotorului21 și pot influența pragul de activare a celulelor NK18. Aceste date susțin ideea că există o diversitate alelică extinsă, nedocumentată până în prezent, între receptorii Ly49, cu consecințe probabil importante pentru funcția celulelor NK în mediul sălbatic.

Am dorit să înțelegem echilibrul expresiei receptorilor Ly49 activatori și inhibitori pe celulele NK, și astfel am comparat proporțiile de celule NK care exprimă sau nu Ly49D și Ly49G2 (Fig. 6e). Șoarecii sălbatici au avut proporții semnificativ mai mari de celule Ly49D+G- decât șoarecii de laborator, în timp ce șoarecii de laborator au avut proporții semnificativ mai mari de celule Ly49D-G+ decât șoarecii sălbatici (tabelul 2), ceea ce sugerează că celulele NK ale șoarecilor sălbatici ar putea avea un prag de activare mai mic, deși acest lucru va fi puternic influențat de genotipul MHC clasa I și de expresia altor receptori Ly49 care nu au fost analizați aici. Împreună, aceste rezultate arată că celulele NK ale șoarecilor sălbatici pot fi și sunt activate mult mai ușor decât cele ale șoarecilor de laborator, ceea ce poate fi un răspuns necesar la încărcătura ridicată de agenți patogeni din mediul sălbatic.

Șoarecii sălbatici au un răspuns redus al citokinelor la PAMP-uri

În lumina stării de mare activare a sistemului imunitar celular al șoarecilor sălbatici, am măsurat răspunsul imunitar funcțional prin cultivarea splenocitelor în prezența PAMP-urilor (CpG, ligandul pentru TLR9 exprimat endosomal; PG, un agonist TLR2; LPS bacterian, un ligand pentru TLR4) și un mitogen (anticorpi monoclonali pentru moleculele de suprafață ale celulelor T CD3 și CD28). Dintre cele 45 de comparații efectuate între șoarecii sălbatici și cei de laborator (5 condiții de cultură × 9 citokine), au fost observate doar 16 diferențe semnificative între șoarecii sălbatici și cei de laborator, iar în 13 dintre acestea concentrațiile de analiți au fost semnificativ mai mici la șoarecii sălbatici (Fig. 7, Date suplimentare 1, Tabelul suplimentar 5). De remarcat, șoarecii sălbatici au produs semnificativ mai puțină IL-12 (p40 și p70) și mai puțină IL-13 decât șoarecii de laborator ca răspuns la liganzii legați de agenții patogeni și a existat, de asemenea, o tendință ca producția de IL-10 să fie mai mică la șoarecii sălbatici, deși acest lucru a fost semnificativ doar la momentul inițial. Aceste răspunsuri relativ scăzute la citokine sunt în contrast semnificativ cu starea imunitară celulară foarte activată a șoarecilor sălbatici. Speculăm că o anumită formă de toleranță imună înnăscută poate funcționa pentru a limita gradul de inflamație la șoarecii sălbatici expuși în mod cronic și puternic la agenți patogeni. Singurele răspunsuri la citokine care au fost semnificativ mai mari la șoarecii sălbatici decât la șoarecii de laborator au fost răspunsurile IFN-γ, IL-4 și MIP-2α la anti-CD3/anti-CD28, care sunt în concordanță cu proporțiile mai mari de celule T cu memorie și efectoare la șoarecii sălbatici. Aceste rezultate sugerează că răspunsurile citokinelor înnăscute și efectele lor funcționale ar putea fi reevaluate la șoarecii de laborator.