Mäuse

Alle tierexperimentellen Verfahren und alle Arbeiten an Mäusen wurden vom Ausschuss für Tierschutz und Tiernutzung der China Agriculture University genehmigt (Genehmigungsnummer: SKLAB-2016-01-04). CD1- und 129-Mäuse wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. bezogen. Actin-GFP-Mäuse stammten aus dem Labor von Shaorong Gao an der Tongji-Universität. Alle Mäuse wurden unter spezifisch pathogenfreien (SPF) Bedingungen mit einem 12-Stunden-Dunkel-/12-Stunden-Licht-Zyklus zwischen 06:00 und 18:00 Uhr in einem temperaturkontrollierten Raum (22 ± 2 °C) mit freiem Zugang zu Wasser und Futter gehalten.

Stammzelllinien und Zellkultur

G4 und G4-ACTB-DsRed-MST ESCs wurden vom Labor von Dr. Andras Nagy, Kristina Vintersten und Marina Gertsenstein im Mount Sinai Hospital & dem Samuel Lunemfeld Forschungsinstitut bezogen. Die doppelt transgenen ESC-Linien Blimp1-mVenus und Stella-ECFP (BVSC), die membrangesteuertes Venus (mVenus) unter der Kontrolle von Prdm1 (Blimp1) und verstärktes CFP (ECFP) unter der Kontrolle von Dppa3 (Stella/Pgc7) exprimieren, wurden von Dr. Mitinori Saitou45,46 erhalten.

Für die Erzeugung der Lefty1-mCherry-Maus-XEN-Zelllinie wurden der Lefty1-Promotor und das fluoreszierende Protein mit Hilfe des Sleeping Beauty-Transposon-Systems in XEN-Zellen integriert, das aus zwei Komponenten besteht: dem aus pT2/LTR7-GFP modifizierten Transposon-Vektor (addgene#62541) und dem Transposase-Vektor (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879). PT2/LTR7-GFP wurde mit „puro“-Schloss ergänzt, das Puromycin-N-Acetyltransferase exprimieren kann, und die GFP-CDS-Region wurde durch mCherry ersetzt. Das DNA-Fragment, das mit dem Primer PT2-F (GTTTGGACAAACCACAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACATCATTTTCTG) aus pT2/LTR7-GFP amplifiziert wurde, wurde mit dem „puro“-Schloss und der CDS-Region von mCherry gekoppelt, um den Vektor PT2-Puro-mCherry unter Verwendung des NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs) zu erhalten. Die Promotorsequenz des Lefty1-Gens wurde aus der DNA von ES-Zellen der Maus mit Lefty1-F (GTCCGGTGGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTTGAGTCTGCGG) amplifiziert. Anschließend wurde die Promotorsequenz des Lefty1-Gens mit Hilfe des NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs) an PT2-Puro-mCherry angefügt, wobei PT2-Puro-mCherry mit EcoRI linearisiert und die Überlappungssequenz, die die EcoRI-Sequenz enthält, an die Promotorsequenz des Lefty1-Gens angefügt wurde. Der Vektor wurde PT2-Puro-mCherry-Lefty1 genannt. Anschließend wurden PT2-Puro-mCherry-Lefty1 und pCMV(CAT)T7-SB100 in Maus-XEN-Zellen transfiziert und mit 2 μg pro mL Puromycin für nachfolgende Analysen gescreent.

Für die Erzeugung von Lamc1 (Laminin, gamma 1) Knockout-Zelllinien wurden zwei sgRNA-Sequenzen (GGAGTACTGCGTGCAGACTGGGG und GCTTTGCCACCAGGTGGTGTCGG), die auf das Exon1 von Lamc1 abzielen, zur Konstruktion eines dualen sgRNA-Vektors verwendet. Fragmente, die zwei sgRNA-Sequenzen enthalten, wurden mit Hilfe von Primern (Lamc1sg1-F: atgcgtctcacaccggagtactgcgtgcagactggttttagagctagaaatagcaag und Lamc1sg2-R: atgcgtctcgaaacacaccacctggtggcaaagcggtgtgtttcgtcctttccacaag) aus PUC-U6-sgRNA-Kana (Huang Xingxu Labor) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit BsmbI verdaut und mit linearisiertem PX330-GFP ligiert. Die Vektoren wurden mit Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific) in ESCs bzw. XENCs transfiziert. Anschließend wurden GFP-positive Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie sortiert und für das monoklonale Wachstum verdünnt. Die DNA wurde aus den erhaltenen monoklonalen Zellen extrahiert und einer PCR-Amplifikation und Sequenzierung unterzogen. Knockout-positive Zellen wurden für Folgeexperimente ausgewählt.

Für die Erzeugung von Nodal-Knockout-Zelllinien wurden gRNA-Sequenzen, die auf das Exon1 von Nodal abzielen (GCCCTCGTCACCGTCCCCTCTGG), für die Konstruktion von sgRNA-Vektoren verwendet. Primer für Nodal sgRNA (Nodal-sgF: caccgccctcgtcaccgtcccctc und Nodal-sgR: aaacgaggggacggtgacgagggc) wurden annealed und das annealed Produkt wurde an linearisiertes PX330-GFP durch BbsI ligiert. Die Vektoren wurden mit Lipofectamine 3000 in ESCs transfiziert und GFP-positive Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie sortiert und für die monoklonale Vermehrung verdünnt. Die DNA wurde aus den erhaltenen monoklonalen Zellen extrahiert und einer PCR-Amplifikation und Sequenzierung unterzogen. Knockout-positive Zellen wurden für Folgeexperimente ausgewählt.

Für die Erzeugung einer p53-Knockout-ESC-Linie wurde die sgRNA-Sequenz für die p53-Mutation mithilfe des CRISPR-Cas9-Systems59 in den PX330-GFP-Vektor (addgene, #48138) geklont. Der Vektor wurde mit Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific) in G4 ESCs transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurden die GFP-positiven Zellen sortiert und auf 6-Well-Platten ausplattiert. Die Kolonien wurden entnommen, und die Knockout-Regionen wurden mittels PCR unter Verwendung von Primern (F: CATCCAGGCGGGAAATAGAGAC; R: CCTGACTGTGTGTAAACTAGGC) amplifiziert und sequenziert. Durch Alignment mit der Wildtyp-Sequenz wurden homozygote Knockout-Zellkolonien identifiziert und für weitere Untersuchungen ausgewählt.

ESCs wurden in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) mit 15% (v/v) FBS (Gibco, ES cell qualified), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM nicht-essentielle Aminosäuren (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM Natriumpyruvat (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% Penicillin-Streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1000 IU LIF (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM PD0325901 (4423, Tocris) und 3 µM CHIR99021 (4192, Tocris). Die ESCs wurden bei 37 °C und 5 % CO2 auf gelatinierten und mit Feeder beschichteten Well-Platten für Gewebekulturen kultiviert und passagiert, wenn eine Konfluenz von 80 % erreicht war.

TSCs wurden aus E3,5-Blastozysten gewonnen, die aus dem Uterus von 5 Wochen alten weiblichen CD1-Mäusen gespült wurden15,60. Die Blastozysten wurden auf mitotisch inaktivierten Maus-MEF-Zellen (Feeder-Zellen) mit TSC-Kulturmedium kultiviert: fortgeschrittenes RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 20 % (v/v) FBS (Gibco, ES-Zell qualifiziert), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-Mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM Natriumpyruvat (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng pro mL rekombinantes humanes FGF4 (235-F4-025, R&D) und 1 µg pro mL Heparin (07980, Stem Cell). Bis sich die Auswüchse an Tag 4 gebildet hatten, wurden sie anschließend durch 5-minütige Inkubation in 0,1 % Trypsin-EDTA im Inkubator aufgetrennt. Frisches, mit 70%igen embryonalen Fibroblasten konditioniertes Mausmedium, das FGF4 und Heparin enthält, zugeben, um die Reaktion zu stoppen, und wieder in den Inkubator stellen. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis TS-Zellkolonien beobachtet werden können, und wechseln Sie das Medium mit TSC-Kulturmedium, um die Zellen zu erhalten. TSC-Zelllinien, die EGFP (TSC-EGFP) exprimieren, wurden von Wildtyp-TSCs abgeleitet, die mit dem PB-UBC-EGFP-Vektor mittels JetPrime (114-15, Polyplus transfection) transfiziert wurden. Die TSC wurden bei 37°C und 5% CO2 auf gelatinierten und mit Feeder bedeckten Tissue Culture Grade Well-Platten kultiviert und bei Erreichen von 80% Konfluenz passagiert. Das Kulturmedium wurde täglich gewechselt.

XENCs wurden aus E3,5-Blastozysten gewonnen, die aus dem Uterus von 5 Wochen alten weiblichen 129-Mäusen unter modifizierten XENC-Bedingungen61 gespült wurden. Maus-Blastozysten wurden auf Feeder-Zellen kultiviert, bis sie am 4. Tag einen Auswuchs bildeten, der anschließend durch 5-minütige Inkubation in 0,1 % Trypsin-EDTA im Inkubator aufgespalten wurde. Frisches Maus-ES-Zellmedium ohne PD0325901 und CHIR99021 zugeben, um die Reaktion zu stoppen, und das Medium jeden zweiten Tag austauschen, bis XEN-Zellkolonien zu beobachten sind. XEN-Zellkolonien wurden mit XEN-Standardmedium aufrechterhalten: fortgeschrittenes RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 15% (v/v) FBS (Gibco) und 0,1 mM β-Mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1% Penicillin-Streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific). Die XENC-EGFP-Zelllinie wurde direkt aus Actin-EGFP-Maus-Blastozysten gewonnen. Für die feederfreie Kultur wurden die XENCs auf mit Gelatine beschichteten Gewebekultur-Wellplatten gehalten. Die XEN-Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Sie wurden entnommen, sobald sie eine Konfluenz von 90 % erreicht hatten. Das Kulturmedium wurde täglich gewechselt.

Generierung von selbst zusammengesetzten Embryonen

ESCs, die 80 % Konfluenz erreicht hatten, wurden einmal mit PBS (14190-094, Gibco) gewaschen und 5 Minuten bei 37 °C in TrypLE (12605010, Thermo Fisher Scientific) inkubiert. TSCs und XENCs wurden durch Inkubation mit 0,1 % Trypsin-EDTA (25300054, Thermo Fisher Scientific) bei 37 °C in einzelne Zellen dissoziiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 1000 U/min für 5 Minuten pelletiert. Das Pellet wurde in rekonstruiertem Embryomedium durch Pipettieren zu einzelnen Zellen re-suspendiert. Die Zellen wurden automatisch mit einem automatischen Zellzähler gezählt.

Für ETX-Embryoide werden ESCs, TSCs und XNECs in einer Zellzahl von 1 × 105, 1 × 105 bzw. 2 × 105 gemischt (für ETS-Embryoide werden ESCs und TSCs in einer Zellzahl von 1 × 105 bzw. 1 × 105 gemischt; für EXE-Embryoide mischen Sie ESCs und XENCs mit einer Zellzahl von 1 × 105 bzw. 1 × 105) mit 2 mL rekonstruiertem Embryomedium pro unbehandelter 35-mm-Zellkulturschale. Bewegen Sie die Schale auf den horizontalen Rotatoren bei 37 °C, 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit. Die Rotationsgeschwindigkeit beträgt 60 U/min pro Minute. Das Medium für rekonstruierte Embryonen besteht aus 39 % fortgeschrittenem RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) und 39 % DMEM (11960069, Thermo Fisher Scientific), ergänzt durch 17,5 % FBS (Gibco, ES-Zellen geeignet), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-Mercaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM MEM nicht-essentielle Aminosäuren (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM Natriumpyruvat (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% Penicillin-Streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific). Das Medium wurde täglich mit 2 mL frischem Medium für rekonstruierte Embryonen ausgetauscht.

EXE-Embryonen bildeten sich gleichmäßig und effizient, die funktionellen Experimente können ohne Selektion von regelmäßigen oder unregelmäßigen Strukturen durchgeführt werden. Für die funktionellen Experimente von ETX-Embryoiden und ETS-Embryoiden wählten wir die regulären Strukturen auf der Grundlage ihrer Morphologie und der entsprechenden Proportionen und Positionen der ESC- und TSC-Kompartimente durch Anzeige von TSC-EGFP unter dem Stereo-Fluoreszenzmikroskop aus.

Gewinnung von Wildtyp-Embryonen und In-vitro-Kultur

Blastozysten wurden aus E4,5 superovulierten trächtigen weiblichen Mäusen durch Uterusspülung mit M2 (MR-015-D, Millipore) gewonnen. Kultivierung der Embryonen in IVC-Medium nach Entfernung des Mural-Trophektoderms in vitro auf 8-Well μ-Slides (80826, Ibidi)62. Für die Gewinnung von E5,5-, E5,75- und E6,5-Embryonen wird die Dekidua aus dem Uterus nach dem beschriebenen Protokoll herausgeschnitten63. Für die EPI-Explantate aus CD1-Mäusen wurden die Embryonen am Tag E5.0 wie zuvor berichtet28 seziert und in vitro mit ETX-Embryoidenmedium kultiviert.

Immunfluoreszenzfärbung

Mausembryonen und rekonstruierte Embryonen wurden mit 4% Paraformaldehyd (DingGuo, AR-0211) bei 4 °C für 20 Minuten fixiert und dreimal mit Waschpuffer (PBS mit 0,1% Tween-20) gewaschen. Anschließend wurden die Embryonen mit 0,5 % Triton X-100 (H5142, Promega) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur permeabilisiert und mit primären Antikörpern in Blocking-Puffer (3 % BSA, 0,3 % Triton X-100) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen, um ungebundene primäre Antikörper zu entfernen, wurden die Zellen mit sekundären Antikörpern in Blocking-Puffer über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Zellkerne wurden mit DAPI angefärbt und anschließend zweimal mit Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurden sie in Fluoroshield Mounting Medium mit DAPI (104140, abcam) montiert. Die Bilder wurden mit einem Nikon A1 Konfokalmikroskop aufgenommen.

Bilder mit Verarbeitung und Analyse

Bilder für Mausembryonen und rekonstruierte Embryonen wurden mit einem Nikon A1 Konfokalmikroskop mit einem 20 × oder 40 × Objektiv aufgenommen. Alle Analysen wurden mit der Open-Source-Bildanalysesoftware “Fiji“ durchgeführt. Das Gewebevolumen und die Zellzahlen der rekonstruierten Embryonen und der Wildtyp-Embryonen wurden geschätzt, und die Messung der Immunfluoreszenzintensität für die Analyse der PCX-Verteilung wurde ebenfalls mit der Fiji-Software9 durchgeführt.

High-throughput single-cell qPCR and data processing

Für die Einzelzellisolierung wurden bestimmte Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien (0, 24 und 84 h) aus zwei Arten von ETX-Embryoiden gesammelt, die mit Lefty1-mCherry XENC (LC-ETX-Embryoide) bzw. BVSC ESC (BVSC-ETX-Embryoide) Reporterzelllinien rekonstruiert wurden. Um die einzelnen Zellen zu isolieren, wählen wir nur die LC-ETX-Embryoide mit DVE/AVE-ähnlichen Geweben aus, die durch asymmetrische Expression der mCherry-Proteine identifiziert werden, und wählen die BVSC-ETX-Embryoide mit asymmetrischer Expression der mVenus-Proteine im ESC-Kompartiment nahe der Grenze zwischen dem ESC- und dem TSC-Kompartiment aus. Für LC-ETX-Embryoide wurden 0, 24 und 84 h LC-negative ESC-abgeleitete Zellen (LC- XEN) sowie 84 h positive ESCs (BVSC+ ES) von der gegenüberliegenden Seite von LC- XEN gesammelt. Für BVSC-ETX-Embryoide wurden 0, 24 und 84 h BV-negative ESC-abgeleitete Zellen (BVSC- ES) sowie 84 h positive ESCs (BVSC+ ES) von der gegenüberliegenden Seite von BVSC- ES gesammelt. Zusätzlich wurden einzelne Zellen aus TSC-Kompartimenten in den ETX-Embryoiden, die mit BVSC-ESCs nach 0, 24 und 84 h assembliert wurden, anhand des EGFP-Reporters gesammelt.

Für die Einzelzellseparation wurden alle ETX-Embryoide in 0,1% Trypsin-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, USA) für 5 min bei 37 °C inkubiert und dann in M2-Medium (MR-015-D, Millipore) überführt. Nach mehrmaligem, sanftem Pipettieren mit dem Mund wurden einzelne Zellen mit einer fein gezogenen Glasspitze isoliert. Im Durchschnitt wurden für jeden Typ 30-40 Zellen gesammelt. Jede Zelle wurde dreimal in phosphatgepufferter Dulbecco-Salzlösung (Invitrogen, Carlsbad, USA) mit 0,1 % BSA (Sigma-Aldrich, MO, USA) gewaschen und zur Lyse, sequenzspezifischen reversen Transkription und Voramplifikation in den RT-PCR-Mastermix gegeben, wie in einem früheren Bericht beschrieben64.

Für das Design und die Validierung der Primer wurden Gene ausgewählt, die die Differenzierung der Zelllinien (hauptsächlich vom E3.5 bis E6.5 Stadium) regulieren und an dominanten Signalwegen beteiligt sind (z.B., Wnt, Nodal-Signalweg), wurden entsprechend der Embryogenese der Maus ausgewählt. Die mRNA-Sequenzen für jedes interessierende Gen wurden vom NCBI abgerufen, und bei Genen mit unterschiedlichen Transkripten wurden nur gemeinsame Regionen verwendet. Genspezifische qRT-Primer wurden mit der Primer3-Software in einer Länge von 100-250 bp entworfen. Alle Primer wurden mit cDNA von Mausembryonen (Mischung aus E5.5 und E6.5) auf Amplifikationseffizienz und Spezifität getestet (aufgelistet in ergänzenden Daten 1).

Einzellige sequenzspezifische Voramplifikation ähnlich wie in früheren Berichten65. Insgesamt wurden 96 Primer-Sets mit einer Endkonzentration von 0,1 μM für jeden Primer gepoolt. Einzelne aus Embryonen isolierte Zellen wurden in sterile Mikroröhrchen mit 5 μl RT-PCR-Mastermix überführt, der 2,5 μl CellsDirect-Reaktionsmix (Invitrogen, Carlsbad, USA), 0,5 μl Primer-Pool, 0,1 μl RT/Taq-Enzym (Invitrogen, Carlsbad, USA) und 1,9 μl nukleasefreies Wasser (Invitrogen, Carlsbad, USA) in jedem Röhrchen enthielt. Die Röhrchen wurden sofort auf Trockeneis eingefroren. Nach einer kurzen Zentrifugation bei 4 °C wurden die Röhrchen sofort in die PCR-Maschine gestellt. Die Zelllyse und die sequenzspezifische reverse Transkription erfolgten bei 50 °C für 1 Stunde. Anschließend wurden die reverse Transkriptase inaktiviert und die Taq-Polymerase durch Erhitzen auf 95 °C für 3 Minuten aktiviert. Anschließend durchlief die cDNA im selben Röhrchen 20 Zyklen der sequenzspezifischen Amplifikation durch Denaturierung bei 95 °C für 15 s und Annealing und Elongation bei 60 °C für 15 min. Um Verdunstung zu vermeiden, wurden die resultierenden Produkte bei -80 °C gelagert.

Für die mikrofluidische quantitative Einzelzell-PCR mit hohem Durchsatz wurden alle voramplifizierten cDNA-Produkte mit dem Echtzeit-PCR-System (ABI 7500) unter Verwendung des endogenen Kontrollgens Actinb validiert, wobei nur Schwellenwerte (Ct) zwischen 9 und 12 für das nachfolgende Experiment ausgewählt wurden. Amplifizierte Einzelzellproben wurden mit SsoFast EvaGreen Supermix mit Low ROX (Bio-Rad, Kalifornien, USA) und individuellen qPCR-Primern in 96 × 96 dynamischen Arrays auf einem Biomark System (Fluidigm, San Francisco, USA) analysiert. Die Berechnung der Ct-Werte erfolgte mit der BioMark Real-Time PCR Analysis Software (Fluidigm, San Francisco, USA).

Für die Verarbeitung und Visualisierung der Einzelzelldaten wurden alle rohen Ct-Werte aus dem BioMark System in relative Log2-Expressionsniveaus umgewandelt, indem die Werte vom angenommenen Hintergrund-Ct-Wert von 26 subtrahiert wurden. Proben mit geringer oder fehlender Expression von endogenen Kontrollgenen (Actinb und Gapdh) wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. PLS-DA wurde auf die Expressionsdaten angewendet, um Zellgruppen in verschiedenen ETX-Embryoiden mit dem R-Paket mixOmics66 zu unterscheiden. Hierarchisches Clustering wurde mit euklidischen Abständen durchgeführt, und Dendrogramme wurden entlang der zeilenskalierten Heatmaps mit dem FluidigmSC-Paket angezeigt. Box-Plots und Violin-Plots wurden mit der Software Origin 8.6 und R erstellt.

BVSC ESC-Chimeric Embryo-Produktion

Wir produzierten die BVSC ESC-Chimeric Embryos durch 8-Zell-Embryo-Injektionsmethode mittels Piezo-Mikromanipulation67. Um sicherzustellen, dass die Wirtsembryonen vor der Verdichtung injiziert wurden, entnahmen wir die Embryonen im Zweizellstadium und kultivierten sie in vitro. Um Embryonen im Zweizellstadium zu erhalten, wurden 5 Wochen alte weibliche Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 5 internationalen Einheiten (IE) PMSG superovuliert, gefolgt von 5 IE HCG 46-48 Stunden später, und mit männlichen Mäusen verpaart. Embryonen im Zweizellstadium wurden durch Spülung des Eileiters mit M2 bei E1,5 gewonnen. Die Embryonen wurden in M2 (MR-015-D, Millipore) gewaschen und dann in 10 μl KSOM (MR-020P-5F, Millipore), die mit Mineralöl bedeckt waren, auf eine Gewebekulturschale übertragen. Die Embryonen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 in einem Inkubator gehalten.

Etwa 15 ES-Zellen wurden mittels Piezo-Mikromanipulation67,68 in Embryonen im 8-Zell-Stadium injiziert. Acht Wochen alte CD1-Weibchen, die mit vasektomierten Männchen gepaart waren, wurden als pseudoträchtige Mäuse verwendet. Injizierte Blastozysten wurden 2,5 Tage post coitum (dpc) in die Gebärmutter der pseudoträchtigen Weibchen übertragen. Embryonen im Morulastadium mit injizierten ESCs wurden in den Eileiter von Empfängerinnen im Alter von 0,5 dpc transferiert. Wir transferierten 14-16 Embryonen pro Empfängerin. Bei E6,5 wurden die chimären Embryonen wie oben beschrieben aus den Eizellen entnommen.

Embryotransfer und Implantationsbewertung

Acht Wochen alte CD1-Weibchen, die mit vasektomierten Männchen gepaart waren, wurden als pseudoträchtige Mäuse verwendet. Für rekonstruierte Embryonen wurden 36 h rekonstruierte Sphären (ETX-, ETS- und EXE-Embryoide) in die Uterushörner von pseudoträchtigen CD1-Empfängerinnen zu 2,5 dpc oder 3,5 dpc übertragen. Pro Empfängerin wurden sechzehn bis zwanzig Embryonen transferiert. Die Implantationsstellen wurden am Tag 6,5 durch intravenöse Injektion von 100 μl 1%iger Chicago Sky Blue-Lösung identifiziert und gezählt. Die Länge und der Radius jeder Dekidua wurden mit einer Bildanalysesoftware gemessen, und das Volumen wurde aus diesen Messungen als V = πr2l berechnet.

HE-Färbung und Immunfärbung der Implantationsstellen

Um das Entwicklungspotenzial der selbstgebildeten Embryonen zu untersuchen, sammelten wir Dekidua in verschiedenen Stadien, darunter 48, 72 und 84 Stunden nach der Transplantation. Diese rekonstruierten Embryonen (ETX, EXE und ETS) wurden über Nacht bei 4 °C mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit Gradientenalkoholen dehydriert, in Xylol überführt und in Paraffin eingebettet. Als Kontrolle wurden E5,5, E6,0 und E6,5 Wildtyp-Embryonen verwendet. Die Proben wurden in 5 μm dicke Scheiben geschnitten, mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und unter dem Mikroskop betrachtet. Deparaffinierte, rehydrierte Proben wurden 10 Minuten lang in einem Mikrowellenherd in Citratpuffer bei ca. 95 °C einem hitzebedingten Epitop-Retrieval unterzogen, anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt und zweimal 3 Minuten lang in PBS gespült. Die Permeabilisierung erfolgte mit 0,5 % Triton X-100 in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Permeabilisierung wurden die Proben dreimal in PBS gewaschen (jeweils 3 Minuten). Anschließend wurden die Proben 30 Minuten lang mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS blockiert und mit primären Antikörpern gegen Kaninchen-anti-CK (ab9377, Abcam), Kaninchen-anti-COX2 (ab15191, Abcam), Kaninchen-anti-Laminin (L9393, Sigma), Ziege-anti-Gata4 (sc-1237, Santa Cruz) oder Maus-anti-PL1 (sc-376436, Santa Cruz) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte dreimal 5 Minuten lang in PBS gewaschen und 30 Minuten lang bei 37 °C mit sekundären Antikörpern inkubiert. Die sekundären Antikörper waren mit Alexa Fluorophore 488 oder 594 (Invitrogen) markiert. Anschließend wurden die Schnitte sechsmal für jeweils 5 Minuten in PBS gespült und mit Fluoroshield-Montagemedium mit DAPI (ab104140, Abcam) montiert. Die Objektträger wurden bis zur Beobachtung bei -20 °C aufbewahrt. Die Bilder wurden mit einem Leica Fluoreszenzmikroskop aufgenommen.

In-situ-Hybridisierung

In-situ-Hybridisierung mit Digoxygenin (DIG) wurde an Kryoschnitten durchgeführt52. Für die Hybridisierung wurden mausspezifische cRNA-Sonden für Dtprp verwendet. Schnitte, die mit Sense-Sonden hybridisiert wurden, dienten als Negativkontrollen. Gefrorene Schnitte (8-10 μm) wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, China) aufgeklebt und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert. Die Schnitte wurden 2 Minuten lang auf einen Objektträgerwärmer (37 °C) gelegt und dann in PBS rehydriert, 15 Minuten lang bei 4 °C in 4 %igem PFA postfixiert, 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Proteinase K (15 μg pro mL) behandelt, 10 Minuten lang zu 0,25 % acetyliert und über Nacht bei 65 °C mit DIG-markierten Sonden hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Schnitte zweimal bei 65 °C gewaschen, anschließend zweimal in 1 × MABT gewaschen und 30 Minuten lang mit RNase (20 μg pro mL) bei 37 °C behandelt. Die Schnitte wurden 1 Stunde lang geblockt und über Nacht im Block mit Anti-DIG-Antikörper (1:2500, Sigma-Aldrich) inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Farbe mit NBT/BCIP entwickelt, bis ein brauner Niederschlag sichtbar war. Die Objektträger wurden mit Nuclear Fast Red gegengefärbt, dehydriert, in Xylol gereinigt und in Cytoseal-Einbettungsmedium montiert. Die Fotos wurden unmittelbar vor dem Verblassen des INT/BCIP-Präzipitats aufgenommen.

Genotyp-Identifizierung der übertragenen selbstgebauten Embryonen

Genomische DNA wurde aus DsRed-ESCs, EGFP-TSCs und ETX-Embryoiden, die aus Decidua-Gewebe isoliert worden waren, mit einem TIANamp Micro DNA Kit (DP316, Tiangen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Das diagnostische Primer-Set EGFP (5ʹ-AGGACGTCATCAAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATAGTCTTCTTCTG-3ʹ) und DsRed (5ʹ-GTGCTTCAGCCGCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCACCTTGATGCCGTTCT-3ʹ) wurden verwendet, um die Region der Zellen und der Proben durch PCR zu identifizieren. Das thermische Profil war 95 °C für 5 min, 35 Zyklen von 95 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 20 oder 40 s und ein abschließender Zyklus bei 72 °C für 5 min.

Statistik

Statistische Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA) für Windows durchgeführt (einschließlich Log2-Expressionsdaten für Einzelzellen). Die Daten wurden mit dem F-Test auf Normalverteilung und gleiche Varianzen geprüft, bevor jeder parametrische statistische Test durchgeführt wurde. Gegebenenfalls wurden zweiseitige Student’s t-Tests mit Welch’scher Korrektur durchgeführt, wenn die Varianz zwischen den Gruppen nicht gleich war. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler der s.e.m. oder s.d. dar. Die Legenden der Abbildungen geben die Anzahl der unabhängigen Experimente an, die in jeder Analyse durchgeführt wurden. Jedes Experiment wurde aus Gründen der Reproduzierbarkeit wiederholt.

Gewebevolumen (Abb. 1i und 7c sowie ergänzende Abb. 4h), Prozentsatz und Anzahl (Abb. 2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m und 7n; ergänzende Abb. 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a und 12g) wurden mit Excel ermittelt. Die Signifikanzanalyse wurde mit dem t-Test von GraphPad Prism durchgeführt. Balkendiagramme wurden mit Excel und GraphPad Prism erstellt, und Streudiagramme wurden mit GraphPad Prism gezeichnet.

Zusammenfassung der Berichterstattung

Weitere Informationen zum Versuchsaufbau sind in der Nature Research Reporting Summary verfügbar, die mit diesem Artikel verlinkt ist.