A community resource

Kompletny zestaw danych immunologicznych 460 dzikich myszy został udostępniony jako zasób społecznościowy (Supplementary Data 1). Na tej podstawie porównujemy szczegółowo podzbiór 181 dzikich myszy (100 samców, 81 samic) z jednego miejsca (miejsce HW, ryc. 1a, tabela uzupełniająca 1) z 64 laboratoryjnie hodowanymi, wolnymi od patogenów myszami C57BL/6 (24 samce, 40 samic). Wyniki tego porównania przedstawiono w tabelach 1,2 i tabeli uzupełniającej 2, przy czym ta ostatnia jest zbyt obszerna, by zmieścić się w głównym tekście artykułu.

Dzikie myszy różnią się immunologicznie od myszy laboratoryjnych

Parametry serologiczne i morfometryczne dla dzikich (HW) i laboratoryjnych (C57/BL6) myszy podsumowano w tabeli 1. Myszy dzikie były znacznie mniejsze niż myszy laboratoryjne (ważące tylko połowę mniej), a wśród myszy dzikich wiek, długość ciała i masa były silnie skorelowane (długość i masa, korelacje Pearsona (dwuogonowe) r=0,79; wiek i masa, r≥0,77; wiek i długość, r=0,58, P<0,001, n>80 osobno dla samców i samic) (Dane uzupełniające 2). Dzikie myszy miały medianę wieku 6,6 tygodnia (zakres 1-39,5), a wiele parametrów immunologicznych korelowało z wiekiem i wielkością, prawdopodobnie ze względu na skumulowaną ekspozycję na infekcję (Dane uzupełniające 2). Spośród 62 pomiarów immunologicznych większość (57 pomiarów) różniła się pomiędzy dzikimi i laboratoryjnymi myszami (Tabela 1, Tabela 2, Uzupełniająca Tabela 2). Wśród myszy dzikich było bardzo niewiele (6 z 62 miar) istotnych różnic immunologicznych między samcami i samicami, podczas gdy myszy laboratoryjne były bardziej (18 z 62 miar) immunologicznie dymorficzne płciowo (Tabela 1, Tabela 2, Tabela uzupełniająca 2).

Multilocus genotypowanie pokazuje, że dzikie myszy HW są nieuporządkowaną, genetycznie zróżnicowaną populacją (ryc. 1b, dane uzupełniające 3). Dzikie myszy różnią się genetycznie od dziesięciu laboratoryjnych szczepów myszy, a szczepy laboratoryjne są bardziej zróżnicowane genetycznie niż dzikie myszy. Sugerujemy, że ta genetyczna zależność między dzikimi i laboratoryjnymi myszami jest wyjaśniona mozaikowatością genomów myszy laboratoryjnych4, faktem, że myszy laboratoryjne zostały celowo oddzielone od siebie przez wiele pokoleń, a także faktem, że szczepy laboratoryjne są w dużej mierze homozygotyczne.

Dzikie myszy niosą znaczne obciążenie infekcjami

Przebadaliśmy dzikie myszy pod kątem dowodów infekcji wirusami i Mycoplasma pulmonis, oraz pod kątem dowodów infekcji ektopasożytów i nicieni jelitowych; dostawcy potwierdzili, że myszy laboratoryjne są wolne od infekcji. Seroprewalencja różnych infekcji mikrobiologicznych wahała się od 22% dla wirusa minutowego do 92% dla parwowirusa (n=153 dla obu analiz; Tabela uzupełniająca 3). Dzikie myszy były powszechnie zarażone nicieniem Oxyurid Syphacia spp. (częstość występowania 91%) i roztoczem Myocoptes musculinus (częstość występowania 82%) (n=181 w obu przypadkach). Zakażenie dzikich myszy było bardzo powszechne: wszystkie dzikie myszy były zakażone przynajmniej jednym patogenem, a tylko 5% (8 ze 153) było seronegatywne dla wszystkich wirusów i M. pulmonis. Nie stwierdzono wpływu płci na intensywność lub częstość występowania infekcji (tabela uzupełniająca 3).

Dzikie myszy mają bardzo wysokie stężenia białek surowicy

W dzikich myszach stężenia IgG i IgE w surowicy były odpowiednio 20- i 200-krotnie wyższe u dzikich myszy niż u myszy laboratoryjnych (ryc. 2). Wśród myszy dzikich stężenia IgE były istotnie wyższe u samic niż u samców (tab. 1). Natomiast stężenie IgA w kale nie różniło się istotnie między myszami dzikimi i laboratoryjnymi (ryc. 2, tab. 1). Myszy dzikie miały również istotnie wyższe stężenia w surowicy białek ostrej fazy, składnika amyloidu P (SAP) i haptoglobiny niż myszy laboratoryjne (ryc. 2, tab. 1). Różnice te nie wynikały z wyższych całkowitych stężeń białek w surowicy u dzikich myszy, ponieważ stężenia alfa-1 antytrypsyny (AAT) – stabilnego składnika normalnej surowicy – nie różniły się między dzikimi i laboratoryjnymi myszami (ryc. 2, tabela 1).

Dzikie myszy były bardziej heterogeniczne w swoich stężeniach immunoglobulin i białek ostrej fazy w porównaniu z myszami laboratoryjnymi (ryc. 2, tabela 1, tabela uzupełniająca 4). Chociaż podstawowe stężenia SAP są częściowo uwarunkowane genetycznie13, znacząca korelacja między stężeniami SAP i haptoglobiny (korelacje Pearsona (dwuogonowe) r=0,41, P<0,0001, r=0,33, P=0,004 dla 96 samców i 77 samic, odpowiednio; Dane uzupełniające 2) sugerują, że zapalenie i / lub infekcja są prawdopodobnymi czynnikami napędzającymi tę heterogeniczność. Wśród dzikich myszy stężenia IgG i IgE w surowicy były znacząco, dodatnio skorelowane z wiekiem (korelacja Pearsona (dwuogniwowa) r>0,2, P<0,05, n≥79; Dane uzupełniające 2), prawdopodobnie odzwierciedlając skumulowaną ekspozycję na infekcję. Widać to wyraźnie w przypadku stężeń IgE, które były istotnie dodatnio skorelowane z liczbą infekcji bakteryjnych u samców dzikich myszy (korelacja Pearsona (dwuogonowa) r=0,23, P=0,036, n=80; Dane uzupełniające 2). U samic dzikich myszy stężenie IgA w kale było silnie skorelowane z liczbą infekcji mikrobiologicznych oraz z liczbą roztoczy (infekcje mikrobiologiczne korelacja Pearsona (dwuogonowa) r=0,58, P<0,0001, n=35; liczba roztoczy r=-0,380, P=0,01, n=45; Dane uzupełniające 2).

Splenocyty myszy dzikich różnią się od splenocytów myszy laboratoryjnych

Splenocyty myszy dzikich były znacznie mniejsze (około jednej trzeciej masy) niż splenocyty myszy laboratoryjnych i zawierały znacznie mniej (około jednej piątej liczby) zdolnych do życia leukocytów jednojądrzastych (Tabela 1). Co bardziej zaskakujące, śledziony dzikich myszy były znacznie proporcjonalnie mniejsze (to znaczy, w porównaniu z masą ciała) niż myszy laboratoryjnych (Tabela 1).

Cytometria przepływowa ex vivo kwantyfikacja i charakterystyka populacji komórek śledziony (Fig. 3, 4, 5, 6, Uzupełniające ryc. 1) ujawniły, że dzikie myszy miały niższą bezwzględną liczbę komórek T, komórek B, komórek NK, komórek dendrytycznych, makrofagów i neutrofili niż myszy laboratoryjne, co było zgodne z ich niższą bezwzględną liczbą komórek jednojądrzastych śledziony (Dane uzupełniające 1). Ale, proporcjonalnie, śledziony dzikich myszy miały znacznie więcej komórek T, wyższy stosunek komórek T:B i więcej komórek mieloidalnych CD11b+, ale mniej komórek NK i komórek dendrytycznych niż myszy laboratoryjne (Tabela uzupełniająca 2); stosunek komórek CD4+: CD8+ komórek T był również znacznie wyższy u dzikich myszy niż u myszy laboratoryjnych. Różnice te są zgodne z akumulacją komórek T helper i komórek fagocytujących w śledzionie dzikich myszy w odpowiedzi na infekcje systemowe.

Status komórek T CD4+ i CD8+ był wyraźnie różny między dzikimi i laboratoryjnymi myszami. W przypadku komórek T CD4+ znacznie większy odsetek stanowiły komórki pamięci efektorowej/efektorowej (CD62L- CD44hi) i pamięci centralnej (CD62L+ CD44hi) (a więc proporcjonalnie mniej było komórek naiwnych, CD62L+ CD44low), u myszy dzikich w porównaniu z myszami laboratoryjnymi (tabela uzupełniająca 2, ryc. 3a). Chociaż proporcje komórek T CD4+, które były komórkami Treg Foxp3+ CD25+, były nieznacznie wyższe wśród myszy dzikich niż laboratoryjnych (tabela uzupełniająca 2, ryc. 3b), nie było to wystarczające, aby zrównoważyć znacznie większy odsetek efektorowych komórek T CD4+, tak że stosunek efektorowych komórek T CD4+ do Tregs był znacznie wyższy wśród myszy dzikich niż laboratoryjnych (tabela uzupełniająca 2).

Podobnie, w przypadku komórek T CD8+ dzikie myszy miały znacznie wyższy odsetek efektorowych / efektorowych komórek pamięci (CD62L- CD44hi) i komórek terminalnie zróżnicowanych (KLRG1+) niż myszy laboratoryjne (a więc znacznie niższy odsetek naiwnych) (Fig. 3c,d). Dzikie myszy miały również proporcjonalnie mniej komórek CD8+ T pamięci centralnej (CD62L+ CD44hi) niż myszy laboratoryjne; różnica ta wynikała częściowo z niskiej częstotliwości tych komórek u dzikich samców myszy (Tabela uzupełniająca 2), ale może również odzwierciedlać względną dystrybucję komórek CD8+ T doświadczonych antygenem między podgrupami pamięci i efektorowymi. Ponownie, stosunek efektorowych / efektorowych komórek T pamięci CD8+ do Tregs był znacznie wyższy u myszy dzikich niż laboratoryjnych (Tabela uzupełniająca 2).

Zgodnie z ideą, że częste lub uporczywe wyzwanie patogenów napędza ekspansję doświadczonych przez antygen podgrup komórek T CD4+ i CD8+ u dzikich myszy, istniały znaczące dodatnie korelacje między proporcjami efektorowych komórek T CD4+ i CD8+ a wiekiem wśród samic dzikich myszy (korelacje Pearsona (dwuogonowe) wiek i efektorowe komórki T CD4+ r=0,62, P<0,0001, n=51; Wiek i efektorowe CD8+ r=0,49, P<0,0001, n=50; Supplementary Data 2). Co ciekawe, parametry te nie były silnie skorelowane z wiekiem u samców dzikich myszy (korelacja Pearsona (dwuogonowa) r<0,1, P>0,05, n=66), wskazując na różne strategie immunologiczne samców i samic myszy w środowisku naturalnym.

W przeciwieństwie do wysoce primed/efektorowego statusu komórek T śledziony, limfocyty B CD19+ dzikich myszy w przeważającej mierze miały fenotyp naiwny. Skategoryzowaliśmy limfocyty B CD19+ śledziony jako komórki naiwne (CD38+ IgD+), komórki pamięci (CD38+ IgD- GL7-) lub komórki ośrodka zarodkowego (CD38lo IgD- GL7hi)14 i zidentyfikowaliśmy niedawno aktywowane, doświadczone przez antygen komórki na podstawie ich ekspresji MHC klasy II i wiązania aglutyniny arachidowej (PNA; wskazując na ekspresję receptora PNA, PNA-R)15 (ryc. 4a). Pomimo bardzo wysokich stężeń immunoglobulin w surowicy, śledziony myszy dzikich zawierały znacząco wyższe proporcje naiwnych komórek B (i, odwrotnie, znacząco niższe proporcje komórek B pamięci) niż myszy laboratoryjnych (ryc. 4b,c). Ta początkowo sprzeczna z intuicją obserwacja prawdopodobnie odzwierciedla realokację doświadczonych przez antygen komórek B ze śledziony do szpiku kostnego, do innych tkanek limfoidalnych lub do miejsc infekcji, wraz z ciągłym ponownym zasiedlaniem śledziony przez naiwne komórki B pochodzące ze szpiku kostnego. Dzikie myszy miały proporcjonalnie więcej komórek B ośrodka zarodkowego w śledzionie niż myszy laboratoryjne, a wiązanie PNA było porównywalnie wyższe na wszystkich subsetach komórek B u dzikich myszy, co jest zgodne z niedawną aktywacją15 (ryc. 4d, tabela uzupełniająca 2). Razem wyniki te wskazują na wysoki obrót aktywowanych komórek B CD19+ w śledzionach dzikich myszy.

Dzikie myszy mają nieznaną dotychczas populację komórek mieloidalnych

Następnie zidentyfikowaliśmy komórki mieloidalne jako CD11b+ CD11c- (ryc. 5a) i przeanalizowaliśmy ich ekspresję F4/80 i Ly6G, ujawniając cztery subpopulacje komórek F4/80+, oznaczone M1-M4 (ryc. 5b-d). Obejmują one F4/80+ Ly6G- (M1) makrofagi rezydujące w tkankach, F4/80+ Ly6Glow (M2) monocyty/makrofagi czerwonej miazgi oraz F4/80+/-Ly6Ghigh (M4) komórki wielojądrowe (PMN). Populacja M4 PMN mogła być dalej podzielona na neutrofile i komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego w oparciu o ich charakterystykę rozproszenia w przód i w bok (ryc. 5e). Co ważne, u myszy dzikich, ale nie u laboratoryjnych, zidentyfikowaliśmy dodatkową populację komórek F4/80+ wyrażających poziom Ly6G, który jest pośredni między monocytami/makrofagami i PMN (M3). O ile nam wiadomo, jest to nowa, nieopisana wcześniej populacja komórek, którą nazwaliśmy hiper-granulocytarnymi komórkami mieloidalnymi (HGMC) na podstawie ich charakterystyki rozproszenia w przód i w bok (Fig. 5c-e). Chociaż istnieją pewne niewielkie różnice w poziomach ekspresji Ly6G między populacjami M2 i M3/M4 u myszy dzikich i laboratoryjnych (ryc. 5c), wsteczne bramkowanie każdej populacji na CD11b, CD11c oraz rozproszenie w przód i bok potwierdziło, że populacje M2 u myszy dzikich i laboratoryjnych są poza tym identyczne i że populacja Ly6Ghigh u myszy laboratoryjnych odpowiada populacji M4 u myszy dzikich (ryc. 5d). Porównanie rozproszenia bocznego dla każdej populacji potwierdza również, że hipergranulocytarna populacja M3 o wysokim rozproszeniu bocznym jest rzeczywiście widoczna tylko u myszy dzikich (ryc. 5f). Funkcjonalne znaczenie tych komórek nie jest jeszcze znane, ale ich odkrycie podkreśla, że badania myszy laboratoryjnych niekoniecznie ujawniają pełne arsenał układu odpornościowego.

Dzikie myszy nie tylko miały proporcjonalnie więcej komórek mieloidalnych CD11b+ CD11c- w śledzionie niż myszy laboratoryjne, ale w obrębie populacji mieloidalnej PMN i HGMC były wzbogacone kosztem makrofagów i monocytów (Fig. 5a,f, Tabela uzupełniająca 2). Ekspansja i / lub akumulacja neutrofili i HGMC w śledzionach dzikich myszy jest zgodna z niedawną lub bieżącą ekspozycją na infekcję u dzikich myszy. Komórki dendrytyczne CD11c+ w śledzionie były proporcjonalnie rzadsze u dzikich myszy w porównaniu z myszami laboratoryjnymi (Fig. 5g, Tabela uzupełniająca 2).

Komórki NK dzikich myszy są wysoce aktywowane

Charakteryzowaliśmy komórki NKp46+ CD3ɛ- NK (Fig. 6) jako wczesne (etap 1), średnie (etap 2), późne (etap 3) lub w pełni (etap 4) dojrzałe komórki przez ekspresję CD27 i CD11b (Fig. 6a). Dzikie myszy miały wyższy odsetek komórek stadium 1 i stadium 2 oraz niższy odsetek komórek NK stadium 3 i stadium 4, co skutkowało znacznie wyższym stosunkiem wczesnych/średniego stadium komórek NK do późnych/dojrzałych komórek NK niż myszy laboratoryjne (ryc. 6b, tabela 2). Ekspresja markera niedawnej/wczesnej aktywacji CD69 była wyższa we wszystkich podgrupach komórek NK myszy dzikich w porównaniu z myszami laboratoryjnymi (ryc. 6c, tabela 2), ale – poza komórkami stadium 1 – ekspresja markera terminalnego różnicowania KLRG1 była niższa (ryc. 6, tabela 2). Łącznie dane te są zgodne z aktywacją, samoodnawianiem i homeostatyczną ekspansją16, a tym samym wyższym tempem obrotu, komórek NK śledziony dzikich myszy w porównaniu z myszami laboratoryjnymi.

Następnie zbadaliśmy ekspresję rodziny Ly49 receptorów regulacyjnych lektyn typu C na komórkach NK (Fig. 6e-h) rozumując, że stochastyczna ekspresja członków rodziny receptorów Ly49 na poszczególnych komórkach NK w połączeniu z różnorodnością genetyczną populacji może prowadzić do heterogeniczności komórek NK w obrębie osobnika i rozległej zmienności fenotypu komórek NK między osobnikami11. Inhibicyjne receptory Ly49 rozpoznają self-MHC klasy I i zapobiegają zabijaniu zdrowych komórek przez komórki NK, podczas gdy receptory Ly49 rozpoznające ligandy związane z patogenami prowadzą do aktywacji komórek NK i zabijania zainfekowanych komórek; najlepiej opisanym przykładem tego jest wiązanie Ly49H z glikoproteiną m157 cytomegalowirusa myszy (MCMV), która pośredniczy w odporności ochronnej na MCMV (ref. 17).

Przeanalizowaliśmy ekspresję dwóch receptorów aktywujących (Ly49D i Ly49H) i jednego receptora hamującego (Ly49G2). U większości myszy laboratoryjnych C57BL/6 komórki NK wykazywały ekspresję Ly49D, Ly49G i Ly49H (ryc. 6e-h), przy czym 5-45% komórek NK wykazywało ekspresję każdego z receptorów, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami18. W przeciwieństwie do tego bardzo niewiele dzikich myszy miało jakiekolwiek komórki NK Ly49H+ (10%, n=125, ≥1% komórek Ly49H+, Dane uzupełniające 1), co sugeruje, że gen kodujący ten receptor jest rzadki w tej populacji dzikich myszy lub że zmienność alleliczna wyklucza rozpoznanie przez przeciwciało anty-Ly49H. Genotypowaliśmy myszy w locus Ly49h pod kątem delecji, która jest związana z podatnością na MCMV (ref. 17), stwierdzając, że 18% dzikich myszy było homozygotycznych dla tej delecji (95% przedział ufności 9,5-30%, n=98 myszy z miejsca HW; częstotliwość alleli delecji 0,42 przy założeniu równowagi Hardy’ego-Weinberga). To prawdopodobnie częściowo przyczynia się do niedoboru komórek NK Ly49H+ wśród dzikich myszy, ale rodzi pytania o obecność dodatkowych alleli zerowych w locus Ly49h i czy inne receptory mogą zrekompensować brak Ly49H u dzikich myszy, zwłaszcza biorąc pod uwagę wysoką częstość występowania MCMV w populacjach dzikich myszy, zgłaszaną jako 62 i 79% (ref. 19, 20). Widoczny brak Ly49H wśród dzikich myszy może tłumaczyć ich znacznie częstszą ekspresję alternatywnego receptora aktywującego Ly49D i sugeruje, że mogą istnieć istotne różnice między dzikimi i laboratoryjnymi myszami w udziale komórek NK w funkcjonalnej odporności.

Zidentyfikowaliśmy trzy populacje komórek Ly49G2: Ly49G2-, Ly49G2low i Ly49G2high (ryc. 6g). Wśród dzikich myszy większość komórek Ly49G2+ stanowiły komórki Ly49G2low, podczas gdy u myszy laboratoryjnych dominowały komórki Ly49G2high. Sugeruje to obecność różnych alleli w locus kodującym Ly49G2 w populacjach dzikich i laboratoryjnych. Wśród myszy laboratoryjnych różnice między szczepami w ekspresji receptora Ly49G zostały powiązane z różnicami allelicznymi w aktywności promotora21 i mogą wpływać na próg aktywacji komórek NK18. Dane te wspierają ideę, że istnieje szeroka, dotychczas nieudokumentowana, różnorodność alleliczna wśród receptorów Ly49 z prawdopodobnie ważnymi konsekwencjami dla funkcji komórek NK w naturze.

Chcieliśmy zrozumieć równowagę ekspresji aktywujących i hamujących receptorów Ly49 na komórkach NK, a więc porównaliśmy proporcje komórek NK wyrażających lub nie Ly49D i Ly49G2 (ryc. 6e). Dzikie myszy miały znacząco wyższy odsetek komórek Ly49D+G- niż myszy laboratoryjne, podczas gdy myszy laboratoryjne miały znacząco wyższy odsetek komórek Ly49D-G+ niż dzikie myszy (Tabela 2), co sugeruje, że komórki NK dzikich myszy mogą mieć niższy próg aktywacji, chociaż będzie to silnie uzależnione od genotypu MHC klasy I i ekspresji innych receptorów Ly49, które nie były tutaj badane. Łącznie wyniki te pokazują, że komórki NK dzikich myszy mogą być, i są, znacznie łatwiej aktywowane niż komórki myszy laboratoryjnych, co może być konieczną odpowiedzią na wysokie obciążenie patogenami w środowisku naturalnym.

Dzikie myszy mają zmniejszone odpowiedzi cytokinowe na PAMPs

W świetle wysoce aktywowanego stanu komórkowego układu odpornościowego dzikich myszy zmierzyliśmy funkcjonalną odpowiedź immunologiczną poprzez hodowlę splenocytów w obecności PAMPs (CpG, ligand dla endosomalnie wyrażonych TLR9; PG, agonisty TLR2; bakteryjnego LPS, liganda dla TLR4) i mitogenu (przeciwciał monoklonalnych do cząsteczek powierzchniowych komórek T CD3 i CD28). Wśród 45 porównań między myszami dzikimi i laboratoryjnymi (5 warunków hodowli × 9 cytokin) zaobserwowano tylko 16 istotnych różnic między myszami dzikimi i laboratoryjnymi, a w 13 z nich stężenia analitów były istotnie niższe u myszy dzikich (ryc. 7, dane uzupełniające 1, tabela uzupełniająca 5). Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że dzikie myszy produkowały znacznie mniej IL-12 (p40 i p70) i mniej IL-13 niż myszy laboratoryjne w odpowiedzi na ligandy związane z patogenami, a także zaobserwowano tendencję do produkcji IL-10 niższej u dzikich myszy, chociaż było to istotne tylko na linii podstawowej. Te stosunkowo obniżone odpowiedzi cytokinowe są w znacznym kontraście do wysoce aktywowanego komórkowego stanu immunologicznego dzikich myszy. Spekulujemy, że jakaś forma wrodzonej tolerancji immunologicznej może działać w celu ograniczenia stopnia zapalenia u chronicznie i silnie narażonych na patogeny dzikich myszy. Jedyne odpowiedzi cytokinowe, które były znacząco wyższe u dzikich myszy niż u myszy laboratoryjnych, to odpowiedzi IFN-γ, IL-4 i MIP-2α na anty-CD3/anty-CD28, co jest zgodne z wyższymi proporcjami komórek T pamięci i efektorowych u dzikich myszy. Wyniki te sugerują, że wrodzone odpowiedzi cytokinowe i ich funkcjonalne efekty mogą wymagać ponownej oceny u myszy laboratoryjnych.

.