Șoareci

Toate procedurile pe animale și toată munca pe șoareci au fost aprobate de către Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor al Universității de Agricultură din China (Număr de autorizare: SKLAB-2016-01-04). Șoarecii CD1 și 129 au fost obținuți de la Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Șoarecii Actin-GFP au fost obținuți de la laboratorul lui Shaorong Gao de la Universitatea Tongji. Toți șoarecii au fost menținuți în condiții specifice fără agenți patogeni (SPF), cu un ciclu de 12 ore de întuneric / 12 ore de lumină între orele 06:00 și 18:00, într-o cameră cu temperatură controlată (22 ± 2 °C), cu acces liber la apă și hrană.

Liniile de celule stem și cultura de celule

G4 și G4-ACTB-DsRed-MST ESCs au fost obținute de la Laboratorul Dr. Andras Nagy, Kristina Vintersten și Marina Gertsenstein din cadrul Spitalului Mount Sinai & Institutul de Cercetare Samuel Lunemfeld. Linia ESC dublu-transgenică Blimp1-mVenus și Stella-ECFP (BVSC), care exprimă Venus (mVenus) orientată spre membrană sub controlul elementelor de reglare Prdm1 (Blimp1) și CFP îmbunătățită (ECFP) sub controlul Dppa3 (Stella/Pgc7), a fost obținută de la Dr. Mitinori Saitou45,46.

Pentru generarea liniei de celule XEN de șoarece Lefty1-mCherry, promotorul Lefty1 și proteina fluorescentă au fost utilizate pentru a fi integrate în celulele XEN prin sistemul de transpozoni Sleeping Beauty, care constă din două componente: vectorul transpozon modificat din pT2/LTR7-GFP (addgene#62541) și vectorul de transpacitate (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879). PT2/LTR7-GFP a fost adăugat cu castelul „puro”, care ar putea exprima puromicină N-acetiltransferază, iar regiunea CDS GFP a fost înlocuită cu mCherry. Fragmentul de ADN, care a fost amplificat din pT2/LTR7-GFP cu ajutorul primerului PT2-F (GTTTGGACACAAACCACAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACACATCATTTTTTCTG), a fost cuplat cu castelul „puro” și regiunea CDS mCherry pentru a obține vectorul denumit PT2-Puro-mCherry folosind NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs). Secvența promotoare a genei Lefty1 a fost amplificată din ADN-ul celulelor ES de șoarece folosind Lefty1-F (GTCCGGTGGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTTGAGTCTGCGG). Apoi, secvența promotoare a genei Lefty1 a fost adăugată la PT2-Puro-mCherry cu ajutorul NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs), în care PT2-Puro-mCherry a fost liniarizat prin EcoRI, iar secvența de suprapunere care conținea secvența EcoRI a fost adăugată la secvența promotoare a genei Lefty1. Vectorul a fost denumit PT2-Puro-mCherry-Lefty1. Apoi, PT2-Puro-mCherry-Lefty1 și pCMV(CAT)T7-SB100 au fost transfectate în celule XEN de șoarece și au fost ecranate cu 2 μg per ml de puromicină pentru analize ulterioare.

Pentru generarea de linii celulare Lamc1 (laminină, gamma 1) knock-out, au fost utilizate două secvențe sgRNA care vizează (GGAGTACTGCGTGCAGACTGGGG și GCTTTGCCACACCAGGTGGTGGTGTCGG) exonul 1 al Lamc1 pentru construirea unui vector dublu sgRNA. Fragmentele care conțin două secvențe de sgRNA amplificate din PUC-U6-sgRNA-Kana (de la laboratorul Huang Xingxu) folosind primeri (Lamc1sg1-F: atgcgtctcacaccggagtactgcgtgcagcagactggttttagagctagaaatagcaag și Lamc1sg2-R: atgcgtctcgaaacacacaccacctggtggtggcaaagcggtgtgtttcgtcctttccacaag). Produsul PCR a fost digerat cu BsmbI și ligaturat cu PX330-GFP liniarizat. Vectorii au fost transfectați în ESCs și XENCs utilizând Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific), respectiv Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Apoi, celulele GFP-pozitive au fost sortate cu ajutorul citometriei de flux și diluate pentru creștere monoclonală. ADN-ul a fost extras din celulele monoclonale obținute și a fost supus amplificării PCR și secvențierii. Celulele knockout-pozitive au fost selectate pentru experimentele de urmărire.

Pentru generarea de linii celulare Nodal knockout, pentru construirea vectorului sgRNA au fost utilizate secvențe gRNA care vizează (GCCCTCGTCACCGTCCCCCCTCTCTGG) exonul 1 al lui Nodal. Amorsele pentru sgRNA Nodal (Nodal-sgF: caccgccctcgtcaccgtcccctcctc și Nodal-sgR: aaacgaggggacggtgacgaggggc) au fost recorectate, iar produsul recorectat a fost ligat la PX330-GFP liniarizat prin BbsI. Vectorii au fost transfectați în ESC-uri utilizând Lipofectamine 3000 și celulele GFP-pozitive au fost sortate prin citometrie în flux și diluate pentru creștere monoclonală. ADN-ul a fost extras din celulele monoclonale obținute și a fost supus amplificării PCR și secvențierii. Celulele knockout-pozitive au fost selectate pentru experimentele de urmărire.

Pentru generarea liniei ESC p53 knockout, secvența sgRNA pentru mutația p53 a fost clonată în vectorul PX330-GFP (addgene, #48138) folosind sistemul CRISPR-Cas959. Vectorul a fost transfectat în CSE G4 cu Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). La trei zile după transfecție, celulele GFP-pozitive au fost sortate și plasate pe plăci cu 6 godeuri. S-au recoltat colonii, iar regiunile knockout au fost amplificate prin PCR cu ajutorul unor primeri (F: CATCCAGGCGGGGGGAAATAGAGAC; R: CCTGACTGTGTGTGTAAACTAGGC) și secvențiate. Prin alinierea cu secvența de tip sălbatic, au fost identificate colonii de celule homozigote knockout și au fost selectate pentru continuarea studiului.

ESC au fost cultivate în Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) cu 15% (v/v) FBS (Gibco, calificat pentru celule ES), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM aminoacizi neesențiali (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM piruvat de sodiu (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicilină-streptomicină (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1000 UI LIF (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM PD0325901 (4423, Tocris), și 3 µM CHIR99021 (4192, Tocris). CSE au fost cultivate la 37 °C și 5% CO2 pe plăci cu godeuri de grad de cultură tisulară gelatinizate și acoperite cu feeder și au fost trecute în momentul în care s-a obținut o confluență de 80%.

CSE au fost derivate din blastociste E3.5 extrase din uterul unei femele de șoarece CD1 în vârstă de 5 săptămâni15,60. Blastocistele au fost cultivate pe celule MEF de șoarece inactivate mitotic (celule feeder) cu mediu de cultură TSC: RPMI 1640 avansat (11875-093, Thermo Fisher Scientific) suplimentat cu 20% (v/v) FBS (Gibco, calificat pentru celule ES), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM piruvat de sodiu (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% (v/v) penicilină-streptomicină (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng per ml de FGF4 uman recombinant (235-F4-025, R&D) și 1 µg per ml de heparină (07980, Stem Cell). Până la formarea excrescențelor în ziua 4, acestea au fost ulterior dezagregate prin incubare în 0,1% tripsină-EDTA timp de 5 min în incubator. Se adaugă mediu proaspăt condiționat cu 70% fibroblaste embrionare de șoarece, conținând FGF4 și heparină, pentru a opri reacția și se readuce în incubator. Înlocuiți mediul o dată la două zile până când pot fi observate colonii de celule TS și schimbați mediul cu mediu de cultură TSC pentru a menține celulele. Liniile de celule TSC care exprimă EGFP (TSC-EGFP) au fost derivate din TSC de tip sălbatic care au fost transfectate cu vectorul PB-UBC-EGFP prin JetPrime (114-15, Polyplus transfection). TSC au fost cultivate la 37°C și 5% CO2 pe o placă cu puțuri de grad de cultură tisulară gelatinizată și acoperită cu feeder și au fost trecute în momentul în care s-a obținut o confluență de 80%. Mediul de cultură a fost schimbat zilnic.

XENC-urile au fost derivate din blastociste E3.5 extrase din uterul unei femele de șoarece 129 în vârstă de 5 săptămâni, utilizând condiții XENC modificate61. Blastocistele de șoarece au fost cultivate pe celule de hrănire până când au format o excrescență în ziua 4, care a fost ulterior dezagregată prin incubare în 0,1% tripsină-EDTA timp de 5 minute în incubator. Se adaugă mediu proaspăt de celule ES de șoarece fără PD0325901 și CHIR99021 pentru a opri reacția și se înlocuiește mediul o dată la două zile până când pot fi observate colonii de celule XEN. Coloniile de celule XEN au fost menținute cu mediul XEN standard: RPMI 1640 avansat (11875-093, Thermo Fisher Scientific) suplimentat cu 15% (v/v) FBS (Gibco) și 0,1 mM β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1% penicilină-streptomicină (15140122, Thermo Fisher Scientific). Linia celulară XENC-EGFP a fost obținută direct din blastocistul de șoarece Actin-EGFP. Pentru cultura fără hrănire, XENC-urile au fost menținute pe o placă cu puțuri de calitate pentru cultura de țesuturi acoperită cu gelatină. Celulele XENC au fost cultivate la 37 °C și 5% CO2. Au fost trecute odată ce au atins o confluență de 90%. Mediul de cultură a fost schimbat zilnic.

Generarea de embrioni autoasamblați

CSE, care au atins o confluență de 80%, au fost spălate o dată cu PBS (14190-094, Gibco) și au fost incubate timp de 5 minute la 37 °C în TrypLE (12605010, Thermo Fisher Scientific). TSCs și XENCs au fost disociate în celule unice prin incubare cu 0,1% tripsină-EDTA (25300054, Thermo Fisher Scientific) la 37 °C. Celulele au fost peletizate prin centrifugare la 1000 rpm timp de 5 minute. Peletul a fost resuspendat în mediul embrionar reconstruit prin pipetare până la celule unice. Celulele au fost numărate automat cu un contor celular automat.

Pentru embrioizii ETX, se amestecă ESCs, TSCs și XNECs la un număr de celule de 1 × 105, 1 × 105 și, respectiv, 2 × 105 (pentru embrioizii ETS, se amestecă ESCs și TSCs la un număr de celule de 1 × 105 și, respectiv, 1 × 105; pentru embrioizii EXE, se amestecă CSE ș i XENC la un număr de celule de 1 × 105 ș i, respectiv, 1 × 105) cu 2 ml de mediu de reconstrucție embrionară pentru fiecare placă de cultură celulară netratată de 35 mm. Deplasați vasul pe rotatoare orizontale la 37 °C, 5% CO2 și 100% umiditate. Viteza de rotație este de 60 rpm pe minut. Mediul pentru embrioni reconstruiți include 39% RPMI 1640 avansat (11875-093, Thermo Fisher Scientific) și 39% DMEM (11960069, Thermo Fisher Scientific) supliment cu 17,5% FBS (Gibco, calificat pentru celule ES), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM MEM aminoacizi neesențiali (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM piruvat de sodiu (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicilină-streptomicină (15140122, Thermo Fisher Scientific). S-a schimbat mediul cu 2 ml de mediu embrionar reconstruit proaspăt în fiecare zi.

EXE-embrioizi formați în mod constant și eficient, experimentele funcționale pot fi efectuate fără selectarea structurilor regulate sau neregulate. Pentru experimentele funcționale ale ETX-embrioizilor și ETS-embrioizilor, am selectat structurile regulate pe baza morfologiei lor și a proporțiilor și pozițiilor adecvate ale compartimentelor ESC și TSC prin indicarea TSC-EGFP la microscopul cu fluorescență stereo.

Recuperarea embrionilor de tip sălbatic și cultivarea in vitro

Blastocitele au fost recuperate de la femele șoareci gestante superovulate E4.5 prin spălare uterină cu M2 (MR-015-D, Millipore). Cultivarea embrionilor în mediu IVC după îndepărtarea trophectodermului mural in vitro pe μ-Slides cu 8 godeuri (80826, Ibidi)62. Pentru recuperarea embrionilor E5,5, E5,75 și E6,5, disecția deciduei din uter se descrie conform protocolului raportat63. Pentru EPI-explanturile de la șoareci CD1 au fost disecate în ziua E5,0, așa cum s-a raportat anterior28 și cultivate cu mediul ETX-embrioizi in vitro.

Colorarea de imunofluorescență

Embrionii de șoarece și embrionii reconstruiți au fost fixați cu paraformaldehidă 4% (DingGuo, AR-0211) la 4 °C timp de 20 de minute și spălați de trei ori cu un tampon de spălare (PBS conținând 0,1% Tween-20). Apoi, embrionii au fost permeabilizați cu 0,5% Triton X-100 (H5142, Promega) timp de 30 de minute la temperatura camerei și au fost incubați cu anticorpi primari în tampon de blocare (3% BSA, 0,3% Triton X-100) peste noapte la 4 °C. După ce au fost spălate pentru a elimina anticorpii primari nelegate, celulele au fost incubate cu anticorpi secundari în tampon de blocare peste noapte la 4 °C. Nucleul celulelor a fost colorat cu DAPI, urmat de două spălări cu tampon de spălare, apoi au fost montate în Fluoroshield Mounting Medium cu DAPI (104140, abcam). Imaginile au fost capturate cu un microscop confocal Nikon A1.

Imagini cu procesare și analiză

Imaginile pentru embrionii de șoarece și embrionii reconstruiți au fost achiziționate folosind un microscop confocal Nikon A1 cu un obiectiv de 20 × sau 40 ×. Toate analizele au fost efectuate utilizând software-ul de analiză a imaginilor cu sursă deschisă ”Fiji”. Volumul țesuturilor și numărul de celule pentru embrionii reconstruiți și embrionii de tip sălbatic au fost estimate, iar măsurătorile intensității imunofluorescenței pentru analiza distribuției PCX au fost, de asemenea, efectuate cu ajutorul software-ului Fiji9.

QPCR monocelular de mare capacitate și procesarea datelor

Pentru izolarea monocelulară, anumite celule în diferite stadii de dezvoltare (0, 24 și 84 h) au fost colectate din două tipuri de embrioni ETX, care au fost reconstruiți cu liniile celulare reporter Lefty1-mCher XENC (LC-ETX-embrioizi) și, respectiv, BVSC ESC (BVSC-ETX-embrioizi). Pentru a izola celulele unice, selectăm numai embrioizii LC-ETX-embrioizi cu țesuturi asemănătoare DVE/AVE identificate prin expresia asimetrică a proteinelor mCherry și selectăm embrioizii BVSC-ETX-embrioizi cu expresie asimetrică a proteinelor mVenus în compartimentul ESC în apropierea limitei dintre compartimentele ESC și TSC. Pentru embrioizii LC-ETX, s-au colectat celule derivate din CSE negative pentru LC la 0, 24 și 84 de ore (LC- XEN), precum și CSE pozitive la 84 de ore (BVSC+ ES) din partea opusă a LC- XEN. Pentru embrioizii BVSC-ETX, au fost colectate 0, 24 și 84 h de celule derivate din CSE BV negative (BVSC- ES), precum și 84 h de CSE pozitive (BVSC+ ES) din partea opusă a BVSC- ES. În plus, au fost colectate celule unice din compartimentele TSC din ETX-embrioidele asamblate cu BVSC-ESCs la 0, 24 și 84 h, pe baza reporterului EGFP.

Pentru separarea celulelor unice, toate ETX-embrioidele au fost incubate în 0,1% tripsină-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, SUA) timp de 5 minute la 37 °C și apoi transferate în mediu M2 (MR-015-D, Millipore). După pipetarea blândă și repetată cu gura de mai multe ori, au fost izolate celule unice cu un vârf de sticlă fin tras. În medie, au fost colectate 30-40 de celule pentru fiecare tip. Fiecare celulă a fost spălată de trei ori în soluție salină tamponată cu fosfat Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, SUA) care conține 0,1 % BSA (Sigma-Aldrich, MO, SUA) și a fost plasată în amestecul maestru de reacție în lanț a transcripției inverse și a polimerazei (RT-PCR) pentru liză, transcripție inversă specifică secvenței și preamplificare, așa cum este descris în raportul anterior64.

Pentru proiectarea și validarea primerilor, genele care reglează diferențierea liniei celulare (în principal din stadiul E3.5 până la E6.5) și participă la calea de semnalizare dominantă (de ex, Wnt, calea de semnalizare Nodal) au fost selectate, în funcție de embriogeneza șoarecelui. Secvențele ARNm pentru fiecare genă interesată au fost preluate de la NCBI și au fost utilizate doar regiunile comune pentru genele cu transcripții diferite. Cu ajutorul software-ului Primer3 au fost concepuți amperi qRT specifici pentru fiecare genă, cu o lungime de 100-250 bp. Toți primerii au fost testați folosind ADNc de embrioni de șoarece (amestec de E5,5 și E6,5) pentru eficiența și specificitatea amplificării (enumerate în datele suplimentare 1).

Preamplificare specifică secvenței unei singure celule, similară cu raportul anterior65. Un total de 96 de seturi de amorsă au fost grupate la o concentrație finală de 0,1 μM pentru fiecare amorsă. Celulele individuale izolate din embrioni au fost transferate în microtuburi sterile încărcate cu 5 μL de master mix RT-PCR conținând 2,5 μL de mix de reacție CellsDirect (Invitrogen, Carlsbad, SUA), 0,5 μL de pool de amorsă, 0,1 μL de enzimă RT/Taq (Invitrogen, Carlsbad, SUA) și 1,9 μL de apă fără nucleaze (Invitrogen, Carlsbad, SUA) în fiecare tub. Tuburile au fost congelate imediat pe gheață uscată. După o scurtă centrifugare la 4 °C, tuburile au fost introduse imediat în aparatul PCR. Liza celulară și transcrierea inversă a secvenței specifice au fost efectuate la 50 °C timp de 1 h. Ulterior, inactivarea transcriptazei inverse și activarea Taq polimerazei au fost realizate prin încălzire la 95 °C timp de 3 minute. Ulterior, în același tub, ADNc a fost supus la 20 de cicluri de amplificare a secvenței specifice prin denaturare la 95 °C timp de 15 s și recoacere și alungire la 60 °C timp de 15 min. Pentru a evita evaporarea, produsele rezultate au fost depozitate la -80 °C.

Pentru PCR cantitativă monocelulară microfluidică de mare randament, toate produsele cADN preamplificate au fost validate prin sistemul PCR în timp real (ABI 7500) folosind gena de control endogenă Actinb, doar valoarea de trecere a pragului (Ct) cuprinsă între 9 și 12 a fost selectată pentru experimentul ulterior. Eșantioanele unicelulare amplificate au fost analizate cu SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX (Bio-Rad, California, SUA) și primeri qPCR individuali în matrice dinamică 96 × 96 pe un sistem Biomark (Fluidigm, San Francisco, SUA). Calculul valorilor Ct a fost efectuat cu software-ul BioMark Real-Time PCR Analysis (Fluidigm, San Francisco, SUA).

Pentru procesarea și vizualizarea datelor pe o singură celulă, toate valorile Ct brute obținute de la sistemul BioMark au fost convertite în niveluri de expresie relativă Log2 prin scăderea valorilor din valoarea Ct de fond presupusă de 26. Probele cu expresie scăzută sau absentă a genelor de control endogene (Actinb și Gapdh) au fost excluse din analiza ulterioară. PLS-DA a fost aplicat datelor de expresie pentru a discrimina grupurile de celule în diferite ETX-embrioide cu pachetul R mixOmics66. Gruparea ierarhică a fost realizată utilizând distanțe euclidiene, iar dendrogramele au fost afișate de-a lungul hărților termice scalate pe rânduri cu ajutorul pachetului fluidigmSC. Box-plots și violin plots au fost generate cu origin 8.6 și software-ul R.

Producția de embrioni BVSC ESC-Chimeric

Am produs embrionii BVSC ESC-Chimeric prin metoda de injectare a embrionilor cu 8 celule prin Micromanipulare Piezo67. Pentru a ne asigura că embrionii gazdă au fost injectați înainte de compactare, am colectat embrionii în stadiul de două celule și i-am cultivat in vitro. Pentru a obține embrioni în stadiul de două celule, șoarecii femele în vârstă de 5 săptămâni au fost supraovulate prin injectarea intraperitoneală a cinci unități internaționale (UI) de PMSG, urmată de 5 UI de HCG 46-48 de ore mai târziu, și au fost împerecheate cu șoareci masculi. Embrionii în stadiul de două celule au fost colectați prin spălarea oviductului cu M2 la E1,5. Embrionii au fost spălați în M2 (MR-015-D, Millipore) și apoi transferați în picături de 10 μL de KSOM (MR-020P-5F, Millipore) acoperite cu ulei mineral pe o farfurie de cultură de țesut. Embrionii au fost menținuți la 37 °C cu 5% CO2 într-un incubator.

Aproximativ 15 celule ES au fost injectate în embrioni în stadiu de 8 celule prin micromanipulare piezo67,68. Femelele CD1 în vârstă de opt săptămâni împerecheate cu masculi vasectomizați au fost utilizate ca șoareci pseudogravide. Blastocistele injectate au fost transferate în uterul femelelor pseudogravide la 2,5 zile postcoitum (dpc). Embrionii în stadiul de morulă cu CSE injectate au fost transferați în oviductul primitoarelor la 0,5 dpc. Și am transferat 14-16 embrioni pentru fiecare primitoare. La E6,5, am colectat embrionii chimeri din decidui, așa cum am descris mai sus.

Transferul de embrioni și evaluarea implantării

Femele CD1 în vârstă de opt săptămâni împerecheate cu masculi vasectomizați au fost folosite ca șoareci pseudogravide. Pentru embrionii reconstruiți, sferele reconstruite la 36 h (ETX-, ETS- și EXE-embrioizi) au fost transferate în coarnele uterine ale șoarecilor femele CD1 primitoare pseudogravide la 2,5 dpc sau 3,5 dpc. Au fost transferați șaisprezece până la douăzeci de embrioni pentru fiecare primitoare. Locurile de implantare în ziua 6,5 au fost identificate și numărate prin injectarea intravenoasă a 100 μL de soluție Chicago Sky Blue 1%. Lungimea și raza fiecărei decidui a fost măsurată cu ajutorul unui software de analiză a imaginii, iar volumul a fost calculat din aceste măsurători ca V = πr2l.

ColorareaHE și imunomarcația situsurilor de implantare

Pentru a examina potențialul de dezvoltare a embrionilor autoasamblați, am colectat decidui din diverse stadii, inclusiv 48, 72 și 84 h după transplant. Aceste probe de embrioni reconstruiți (ETX, EXE și ETS) au fost fixate cu paraformaldehidă 4% timp de o noapte la 4 °C, deshidratate cu alcooli în gradient, transferate în xilen și încorporate în parafină. Am utilizat embrioni de tip sălbatic E5,5, E6,0 și E6,5 ca martor. Probele au fost tranșate la o grosime de 5 μm, colorate cu hematoxilină și eozină și observate la microscop. Probele desparafinate și rehidratate au fost supuse recuperării epitopice induse de căldură în tampon citrat la aproximativ 95 °C cu un cuptor cu microunde timp de 10 min, după care au fost răcite la temperatura camerei și clătite de două ori în PBS cu 3 min de două ori. Permeabilizarea a fost efectuată cu 0,5 % Triton X-100 în PBS timp de 20 min la temperatura camerei. După permeabilizare, probele au fost spălate în PBS de trei ori (câte 3 min de fiecare). Apoi, probele au fost blocate timp de 30 min cu 5% albumină serică bovină (BSA) în PBS și incubate cu anticorpi primari împotriva Rabbit anti-CK (ab9377, Abcam), Rabbit anti-COX2 (ab15191, Abcam), Rabbit anti-Laminin (L9393, Sigma), Goat anti-Gata4 (sc-1237, Santa Cruz) sau Mouse anti-PL1 (sc-376436, Santa Cruz) la 4 °C peste noapte. În ziua următoare, feliile au fost spălate de trei ori în PBS timp de 5 minute și incubate cu anticorpul secundar timp de 30 de minute la 37 °C. Anticorpii secundari au fost marcați cu Alexa Fluorophore 488 sau 594 (Invitrogen). Ulterior, secțiunile au fost clătite de șase ori în PBS cu 5 min fiecare și montate cu mediu de montare Fluoroshield cu DAPI (ab104140, Abcam). Lamele au fost păstrate la -20 °C până la observare. Imaginile au fost captate cu un microscop fluorescent Leica.

Hibridizare in situ

Hibridizarea in situ cu digoxigenină (DIG) a fost realizată pe criosecțiuni52. Pentru hibridizare au fost utilizate sonde de ARNc specifice șoarecilor pentru Dtprp. Secțiunile hibridizate cu sonde de sens au servit drept controale negative. Secțiunile congelate (8-10 μm) au fost lipite pe lamele acoperite cu poli-l-lizină (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, China) și depozitate la -80 °C până la utilizare. Secțiunile au fost așezate pe un încălzitor de lamele (37 °C) timp de 2 minute, apoi au fost rehidratate în PBS, postfixate în PFA 4% timp de 15 minute la 4 °C, tratate cu proteinază K (15 μg per ml timp de 5 minute la temperatura camerei), acetilate 0,25% timp de 10 minute și hibridizate cu sonde marcate cu DIG peste noapte la 65 °C. S-au efectuat două spălări posthibridizare la 65 °C, urmate de două spălări în 1 × MABT și de 30 de minute de tratament cu RNază (20 μg per mL) la 37 °C. Secțiunile au fost blocate timp de 1 h și incubate peste noapte în bloc cu anticorp anti-DIG (1:2500, Sigma-Aldrich). După spălare, culoarea a fost dezvoltată folosind NBT/BCIP până când a fost vizibil un precipitat maro. Lamele au fost contracolorate cu roșu rapid nuclear, deshidratate și curățate în xilen și montate în mediu de montaj citoseal. Fotografiile au fost realizate cu promptitudine înainte de dispariția precipitatului INT/BCIP.

Identificarea genotipică a embrionilor autoasamblați transferați

Andemnul genomic a fost extras din DsRed-ESCs, EGFP-TSCs și ETX-embrioizi izolați din țesuturile de deciduă cu ajutorul kitului TIANamp Micro DNA (DP316, Tiangen), în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Setul de amorsă de diagnosticare EGFP (5ʹ-AGGACGTCATTCATCAAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATAGTCTTCTTCTTCTG-3ʹ) și DsRed (5ʹ-GTGCTTCTTCAGCCGCTACCCCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCACCTCTTGATGCCGCCGTTCT-3ʹ) au fost utilizate pentru a identifica regiunea celulelor și a probelor prin PCR. Profilul termic a fost de 95 °C timp de 5 min, 35 de cicluri de 95 °C timp de 30 s, 60 °C timp de 30 s și 72 °C timp de 20 sau 40 s și un ciclu final la 72 °C timp de 5 min.

Statistică

Analizele statistice au fost procesate pe software-ul GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA) pentru Windows (inclusiv datele de expresie Log2 pentru o singură celulă). Datele au fost verificate pentru distribuție normală și varianțe egale cu testul F înainte de efectuarea fiecărui test statistic parametric. Atunci când a fost cazul, s-au efectuat teste t Student cu două cozi cu corecția Welch dacă varianța dintre grupuri nu era egală. Barele de eroare reprezintă eroarea standard a s.e.m. sau s.d., după cum s-a specificat. Legendele figurilor indică numărul de experimente independente efectuate în fiecare analiză. Fiecare experiment a fost repetat pentru reproductibilitate.

Volumul țesuturilor (Fig. 1i și 7c, și Fig. suplimentară 4h), calculul procentual și numeric (Fig. 2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m și 7n; Fig. suplimentară 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a și 12g) a fost determinat cu ajutorul Excel. Analiza semnificației a fost efectuată cu ajutorul testului t prin GraphPad Prism. Graficele cu bare au fost desenate de Excel și GraphPad Prism, iar diagramele de dispersie au fost trasate cu GraphPad Prism.

Rezumat de raportare

Informații suplimentare privind designul experimental sunt disponibile în Rezumatul de raportare Nature Research legat de acest articol.

.