En gemenskapsresurs

Den kompletta immunologiska datamängden för 460 vilda möss tillhandahålls som en gemenskapsresurs (Supplementary Data 1). Utifrån detta jämför vi i detalj en delmängd av 181 vilda möss (100 hanar, 81 honor) från en enda plats (plats HW, fig. 1a, kompletterande tabell 1) med 64 laboratorieuppfödda, patogenfria C57BL/6-möss (24 hanar, 40 honor). Resultaten av denna jämförelse visas i tabellerna 1,2 och kompletterande tabell 2, den senare är för stor för att rymmas inom artikelns huvudtext.

Vilda möss skiljer sig immunologiskt från laboratoriemöss

Serologiska och morfometriska parametrar för de vilda (HW) och laboratoriemöss (C57/BBL6) sammanfattas i tabell 1. De vilda mössen var mycket mindre än laboratoriemössen (de vägde bara hälften så mycket) och bland de vilda mössen var ålder, kroppslängd och massa alla starkt korrelerade (längd och massa, Pearsonkorrelationer (tvåsvansade) r=0,79; ålder och massa, r≥0,77; ålder och längd, r=0,58, P<0,001, n>80 för han- och honmöss var för sig) (Supplementary Data 2). De vilda mössen hade en medianålder på 6,6 veckor (intervall 1-39,5) och många immunparametrar korrelerade med ålder och storlek, vilket sannolikt berodde på kumulativ exponering för infektion (Supplementary Data 2). Av 62 immunologiska mått skiljde sig de flesta (57 mått) mellan vilda möss och laboratoriemöss (tabell 1, tabell 2, kompletterande tabell 2). Bland de vilda mössen fanns det mycket få (6 av 62 mått) signifikanta immunologiska skillnader mellan han- och honmöss, medan laboratoriemössen var mer (18 av 62 mått) immunologiskt könsdimorfiska (tabell 1, tabell 2, kompletterande tabell 2).

Multilocus genotypning visar att HW vilda möss är en ostrukturerad, genetiskt diversifierad population (Fig. 1b, Supplementary Data 3). De vilda mössen skiljer sig genetiskt från tio laboratoriemusstammar, och laboratoriestammarna är mer genetiskt diversifierade än de vilda mössen. Vi föreslår att detta genetiska släktskap mellan vilda möss och laboratoriemöss förklaras av mosaikisimen i laboratoriemusens genom4 , av det faktum att laboratoriemöss medvetet har separerats från varandra under många generationer och av det faktum att laboratoriestammar till stor del är homozygota.

Vilda möss bär på en betydande infektionsbörda

Vi undersökte de vilda mössen för bevis på infektion med virus och Mycoplasma pulmonis och för bevis på infektion med ektoparasiter och intestinala nematoder; leverantörerna bekräftade att laboratoriemössen var infektionsfria. Seroprevalensen för de olika mikrobiella infektionerna varierade från 22 % för minutvirus till 92 % för parvovirus (n=153 för båda analyserna; kompletterande tabell 3). Vilda möss var ofta infekterade med den oxyurida nematoden Syphacia spp. (prevalens 91 %) och med kvalstret Myocoptes musculinus (prevalens 82 %) (n=181 i båda fallen). Infektion av vilda möss var mycket vanlig: alla vilda möss hade infekterats med minst en patogen och endast 5 % (8 av 153) var seronegativa för alla virus och M. pulmonis. Det fanns ingen effekt av kön på intensiteten eller prevalensen av infektion (kompletterande tabell 3).

Vilda möss har mycket höga koncentrationer av serumproteiner

I vilda möss var serumkoncentrationerna av IgG och IgE 20- respektive 200-faldigt högre hos vilda möss än hos laboratoriemöss (fig. 2). Bland vilda möss var IgE-koncentrationerna betydligt högre bland honor än bland hanar (tabell 1). Däremot skiljde sig inte de fekala IgA-koncentrationerna nämnvärt mellan vilda möss och laboratoriemöss (fig. 2, tabell 1). Vilda möss hade också betydligt högre serumkoncentrationer av akutfasproteiner, serumamyloid P-komponent (SAP) och haptoglobin än laboratoriemöss (fig. 2, tabell 1). Dessa skillnader berodde inte på högre koncentrationer av totala serumproteiner hos vilda möss eftersom koncentrationerna av alfa-1-antitrypsin (AAT) – en stabil komponent i normalt serum – inte skiljde sig åt mellan vilda möss och laboratoriemöss (fig. 2, tabell 1).

Vilda möss var mer heterogena i sina koncentrationer av immunglobuliner och akutfasproteiner jämfört med laboratoriemöss (fig. 2, tabell 1, kompletterande tabell 4). Även om SAP-koncentrationerna vid baslinjen delvis är genetiskt betingade13 , tyder den signifikanta korrelationen mellan SAP- och haptoglobinkoncentrationerna (Pearsonkorrelationer (tvåsvansade) r=0,41, P<0,0001, r=0,33, P=0,004 för 96 hanar respektive 77 honor; kompletterande uppgifter 2) på att inflammation och/eller infektion är de troliga drivkrafterna bakom denna heterogenitet. Bland vilda möss var serumkoncentrationerna av IgG och IgE signifikant positivt korrelerade med åldern (Pearsons korrelation (tvåstjärtat) r>0,2, P<0,05, n≥79; kompletterande data 2), vilket sannolikt återspeglar kumulativ exponering för infektion. Detta kan uttryckligen ses för IgE-koncentrationer som var signifikant positivt korrelerade med antalet mikrobiella infektioner hos vilda hanmöss (Pearsons korrelation (tvåstjärtat) r=0,23, P=0,036, n=80; kompletterande uppgifter 2). Hos vilda honmöss var den fekala IgA-koncentrationen starkt korrelerad med antalet mikrobiella infektioner och antalet kvalster (mikrobiella infektioner Pearsons korrelation (tvåstjärtat) r=0,58, P<0,0001, n=35; antal kvalster r=-0,380, P=0,01, n=45; kompletterande uppgifter 2).

Vildmusens splenocyter skiljer sig från laboratoriemusens

Spleenerna hos vilda möss var mycket mindre (ungefär en tredjedel av massan) än hos laboratoriemöss och innehöll betydligt färre (ungefär en femtedel av antalet) livskraftiga mononukleära leukocyter (tabell 1). Mer överraskande är att mjälten hos vilda möss var betydligt proportionellt mindre (dvs. jämfört med kroppsmassan) än hos laboratoriemöss (tabell 1).

Ex vivo flödescytometrisk kvantifiering och karakterisering av mjältens cellpopulationer (fig. 3, 4, 5, 6, supplementär fig. 1) visade att vilda möss hade lägre absoluta antal T-celler, B-celler, NK-celler, dendritiska celler, makrofager och neutrofiler än laboratoriemöss, vilket stämmer överens med deras lägre absoluta antal mononukleära celler i mjälten (kompletterande data 1). Proportionellt sett hade vildmusens mjälte dock betydligt fler T-celler, ett högre förhållande mellan T- och B-celler och fler CD11b+ myeloida celler, men färre NK-celler och dendritiska celler än laboratoriemöss (kompletterande tabell 2); förhållandet mellan CD4+: CD8+ T-celler var också betydligt högre hos vilda möss än hos laboratoriemöss. Dessa skillnader är förenliga med ackumulering av T-hjälparceller och fagocytiska celler i mjälten hos vilda möss som svar på systemiska infektioner.

Statusen för CD4+ och CD8+ T-celler skiljde sig markant mellan vilda möss och laboratoriemöss. För CD4+ T-celler var betydligt större andelar effektor-/effektorminnesceller (CD62L- CD44hi) och centrala minnesceller (CD62L+ CD44hi) (och således proportionellt färre var naiva, CD62L+ CD44low), hos vilda möss jämfört med laboratoriemöss (kompletterande tabell 2, fig. 3a). Även om andelen CD4+ T-celler som var Foxp3+ CD25+ Treg-celler var marginellt högre bland vilda än laboratoriemöss (kompletterande tabell 2, fig. 3b) var detta otillräckligt för att uppväga den mycket större andelen effektor-CD4+ T-celler så att förhållandet mellan effektor-CD4+ T-celler och Tregs var signifikant högre bland vilda än laboratoriemöss (kompletterande tabell 2).

För CD8+ T-celler hade vilda möss på liknande sätt en betydligt högre andel effektor-/effektorminnesceller (CD62L- CD44hi) och terminaldifferentierade (KLRG1+) celler än laboratoriemöss (och därmed betydligt lägre andel naiva) (fig. 3c,d). Vilda möss hade också proportionellt sett färre centrala minnesceller (CD62L+ CD44hi) CD8+ T-celler än laboratoriemöss; denna skillnad berodde delvis på den låga frekvensen av dessa celler hos vilda hanmöss (kompletterande tabell 2), men kan också avspegla den relativa fördelningen av antigenerfarna CD8+ T-celler mellan minnes- och effektorsubgrupperna. Återigen var förhållandet mellan effektor-/effektorminnes-CD8+ T-celler och Tregs betydligt högre hos vilda möss än hos laboratoriemöss (kompletterande tabell 2).

Sammanhängande med idén att frekventa eller ihållande patogenutmaningar driver expansion av antigenerfarna CD4+ och CD8+ T-cellsubgrupper hos vilda möss fanns det signifikanta positiva korrelationer mellan andelen effektor-CD4+ och CD8+ T-celler och åldern bland vilda honmöss (Pearsons korrelationer (tvåstjärtat) ålder och effektor-CD4+ r=0,62, P<0,0001, n=51; ålder och effektor CD8+ r=0,49, P<0,0001, n=50; kompletterande data 2). Intressant nog var dessa parametrar inte starkt korrelerade med åldern hos vilda hanmöss (Pearsons korrelation (tvåsvansad) r<0,1, P>0,05, n=66), vilket pekar på olika immunologiska strategier hos han- och honmöss i det vilda.

I motsats till den högprimerade/effektorstatusen hos T-cellerna i mjälten hade CD19+ B-lymfocyter hos vilda möss övervägande en naiv fenotyp. Vi kategoriserade miltära CD19+ B-lymfocyter som naiva (CD38+ IgD+), minnesceller (CD38+ IgD- GL7-) eller celler från germinalcentret (CD38lo IgD- GL7hi)14 och identifierade nyligen aktiverade, antigenerfarna celler genom deras MHC-klass II-uttryck och bindning av jordnötsagglutinin (PNA; vilket indikerar att de uttrycker PNA-receptorn PNA-R)15 (Fig. 4a). Trots mycket höga immunoglobulinkoncentrationer i serum innehöll mjälten hos vilda möss betydligt högre andelar naiva B-celler (och omvänt betydligt lägre andelar minnes-B-celler) än hos laboratoriemöss (fig. 4b,c). Denna till en början kontraintuitiva observation återspeglar troligen en omfördelning av antigenerfarna B-celler från mjälten till benmärgen, till andra lymfoida vävnader eller till infektionsställen, tillsammans med en kontinuerlig återpopulation av mjälten med naiva B-celler som härstammar från benmärgen. Vilda möss hade proportionellt sett fler B-celler med germinalcentrum i mjälten än laboratoriemöss och PNA-bindningen var jämförelsevis högre på alla undergrupper av B-celler hos vilda möss, vilket stämmer överens med en nyligen genomförd aktivering15 (fig. 4d, kompletterande tabell 2). Tillsammans pekar dessa resultat på en hög omsättning av aktiverade CD19+ B-celler i vildmusens mjälte.

Vildmöss har en hittills okänd myeloisk cellpopulation

Vi identifierade därefter myeloiska celler som CD11b+ CD11c- (Fig. 5a) och analyserade deras uttryck av F4/80 och Ly6G, vilket avslöjade fyra subpopulationer av F4/80+-celler, betecknade M1-M4 (Fig. 5b-d). Dessa omfattar F4/80+ Ly6G- (M1) vävnadsresistenta makrofager, F4/80+ Ly6Glow (M2) monocyter/rödmassa-makrofager och F4/80+/-Ly6Ghigh (M4) polymorfonukleära celler (PMN). M4 PMN-populationen kunde delas in ytterligare i neutrofiler och myeloida suppressorceller baserat på deras egenskaper för framåt- och sidospridning (fig. 5e). Viktigt är att vi hos vilda möss, men inte hos laboratoriemöss, identifierade ytterligare en population av F4/80+-celler som uttrycker nivåer av Ly6G som ligger mellan monocyter/makrofager och PMN (M3). Såvitt vi vet är detta en ny population av celler som inte tidigare beskrivits och som vi har kallat hyper-granulocytära myeloida celler (HGMC) på grundval av deras egenskaper när det gäller framåt- och sidospridning (fig. 5c-e). Även om det finns vissa små skillnader i nivåerna av Ly6G-uttryck mellan M2- och M3/M4-populationerna hos vilda möss och laboratoriemöss (fig. 5c) bekräftade back gating av varje population på CD11b, CD11c och framåt- och sidospridning att M2-populationerna hos vilda möss och laboratoriemöss i övrigt är identiska och att den Ly6G-höga populationen hos laboratoriemöss är likvärdig med M4-populationen hos vilda möss (fig. 5d). En jämförelse av sidospridningen för varje population bekräftar också att den hypergranulocytära M3-populationen med hög sidospridning verkligen bara förekommer hos vilda möss (fig. 5f). Den funktionella betydelsen av dessa celler är ännu okänd, men deras upptäckt understryker att studier av laboratoriemöss inte nödvändigtvis avslöjar immunsystemets hela arsenal.

Vilda möss hade inte bara proportionellt sett fler CD11b+ CD11c- myeloida celler i mjälten än laboratoriemöss, utan inom den myeloida populationen var PMN och HGMC berikade på bekostnad av makrofager och monocyter (fig. 5a,f, kompletterande tabell 2). Expansionen och/eller ackumuleringen av neutrofiler och HGMC i mjälten hos vilda möss stämmer överens med att vilda möss nyligen eller för närvarande har utsatts för en infektion. CD11c+ dendritiska celler i mjälten var proportionellt sett mer sällsynta hos vilda möss jämfört med laboratoriemöss (fig. 5g, kompletterande tabell 2).

Vildmusens NK-celler är högt aktiverade

Vi karakteriserade NKp46+ CD3ɛ- NK-celler (fig. 6) som tidiga (stadium 1), medelsvåra (stadium 2), sena (stadium 3) eller helt (stadium 4) mogna celler genom uttryck av CD27 och CD11b (fig. 6a). Vilda möss hade högre andelar av celler i stadium 1 och stadium 2 och lägre andelar av NK-celler i mjälte i stadium 3 och stadium 4, vilket resulterade i betydligt högre proportioner av NK-celler i tidiga/mellanliggande stadier till sena/mogna NK-celler än laboratoriemöss (fig. 6b, tabell 2). Uttrycket av markören CD69 för ny/tidig aktivering var högre på alla undergrupper av NK-celler från vilda möss jämfört med laboratoriemöss (fig. 6c, tabell 2), men – förutom på celler i stadium 1 – tenderade uttrycket av markören KLRG1 för terminal differentiering att vara lägre (fig. 6, tabell 2). Tillsammans är dessa data förenliga med aktivering, självförnyelse och homeostatisk expansion16 , och därmed högre omsättningshastighet, av mjält NK-celler från vilda möss jämfört med laboratoriemöss.

Vi undersökte därefter uttrycket av Ly49-familjen av regulatoriska receptorer för C-typlektiner på NK-celler (Fig. 6e-h), eftersom vi ansåg att det stokastiska uttrycket av medlemmar av Ly49-receptorfamiljen på enskilda NK-celler i kombination med populationens genetiska mångfald kan leda till NK-cellernas heterogenitet inom en individ och en omfattande variation i NK-cellernas fenotyp mellan olika individer11. Inhibitoriska Ly49-receptorer känner igen själv-MHC klass I och hindrar NK-celler från att döda friska celler, medan Ly49-receptorer som känner igen patogenassocierade ligander leder till NK-cellernas aktivering och dödande av infekterade celler; det bäst beskrivna exemplet på detta är bindning av Ly49H till murint cytomegalovirus (MCMV) m157-glykoproteinet, vilket medierar skyddande immunitet mot MCMV (ref. 17).

Vi analyserade uttrycket av två aktiverande receptorer (Ly49D och Ly49H) och en hämmande receptor (Ly49G2). För de flesta C57BL/6-laboratoriemöss uttryckte NK-celler Ly49D, Ly49G och Ly49H (fig. 6e-h) med 5-45 % av NK-cellerna som uttryckte var och en av receptorerna, vilket överensstämmer med tidigare rapporter18. Däremot hade mycket få vilda möss några Ly49H+ NK-celler (10 %, n=125, ≥1 % av Ly49H+-cellerna, Supplementary Data 1), vilket tyder på att genen som kodar för denna receptor är sällsynt i denna population av vilda möss eller att allelvariationen utesluter igenkänning av anti-Ly49H-antikroppen. Vi genotypade möss vid Ly49h-lokuset för en deletion som är förknippad med känslighet för MCMV (ref. 17) och fann att 18 % av de vilda mössen var homozygota för denna deletion (95 % konfidensintervall 9,5-30 %, n=98 möss från HW-platsen; frekvensen av deletionsallelen 0,42 om man utgår från Hardy-Weinberg-jämvikt). Detta bidrar sannolikt delvis till bristen på Ly49H+ NK-celler bland vilda möss, men väcker frågor om förekomsten av ytterligare nollalleler vid Ly49h-lokuset och om andra receptorer kan kompensera för bristen på Ly49H hos vilda möss, särskilt med tanke på den höga prevalensen av MCMV i vilda muspopulationer, som rapporterats vara 62 och 79 % (refs 19, 20). Den uppenbara avsaknaden av Ly49H bland vilda möss kan förklara deras mycket mer frekventa uttryck av den alternativa aktiverande receptorn Ly49D och antyder att det kan finnas viktiga skillnader mellan vilda möss och laboratoriemöss när det gäller NK-cellernas bidrag till funktionell immunitet.

Vi identifierade tre populationer av Ly49G2-celler: Ly49G2-, Ly49G2low och Ly49G2high (fig. 6g). Bland vilda möss var de flesta Ly49G2+-cellerna Ly49G2low, medan Ly49G2high-cellerna dominerade hos laboratoriemöss. Detta tyder på att det finns olika alleler vid Ly49G2-kodningslocus i vilda populationer och laboratoriepopulationer. Bland laboratoriemöss har skillnader mellan olika stammar i uttrycket av Ly49G-receptorn kopplats till allelisk variation i promotoraktivitet21 och kan påverka tröskeln för aktivering av NK-celler18. Dessa data stöder idén att det finns en omfattande, hittills odokumenterad, allelisk mångfald bland Ly49-receptorer med troligen viktiga konsekvenser för NK-cellernas funktion i det vilda.

Vi ville förstå balansen i uttrycket av aktiverande och hämmande Ly49-receptorer på NK-celler, och jämförde därför andelen NK-celler som uttrycker eller inte uttrycker Ly49D och Ly49G2 (fig. 6e). Vilda möss hade betydligt högre andelar Ly49D+G- celler än laboratoriemöss medan laboratoriemöss hade betydligt högre andelar Ly49D-G+ celler än vilda möss (tabell 2), vilket tyder på att NK-celler hos vilda möss kan ha en lägre tröskel för aktivering, även om detta kommer att påverkas starkt av MHC-klass I-genotypen och uttrycket av andra Ly49-receptorer som inte testats här. Tillsammans visar dessa resultat att NK-celler hos vilda möss kan aktiveras och aktiveras mycket lättare än hos laboratoriemöss, vilket kan vara en nödvändig reaktion på den höga patogenbelastningen i den vilda miljön.

Vilda möss har minskade cytokinsvar på PAMPs

I ljuset av det högt aktiverade tillståndet hos det cellulära immunsystemet hos vilda möss mätte vi det funktionella immunsvaret genom att odla splenocyter i närvaro av PAMPs (CpG, ligand för endosomalt uttryckt TLR9; PG, en TLR2-agonist, bakteriell LPS, en ligand för TLR4) och en mitogen (monoklonala antikroppar mot T-cellernas ytmolekyler CD3 och CD28). Bland de 45 jämförelser som gjordes mellan vilda möss och laboratoriemöss (5 odlingsförhållanden × 9 cytokiner) observerades endast 16 signifikanta skillnader mellan vilda möss och laboratoriemöss, och i 13 av dessa var analytkoncentrationerna signifikant lägre hos de vilda mössen (fig. 7, kompletterande data 1, kompletterande tabell 5). Särskilt anmärkningsvärt är att vilda möss producerade signifikant mindre IL-12 (p40 och p70) och mindre IL-13 än laboratoriemöss som svar på patogenrelaterade ligander, och det fanns också en trend att IL-10-produktionen var lägre hos vilda möss, även om detta endast var signifikant vid baslinjen. Dessa jämförelsevis låga cytokinsvar står i betydande kontrast till det högt aktiverade cellulära immunförsvaret hos vilda möss. Vi spekulerar i att någon form av medfödd immuntolerans kan fungera för att begränsa graden av inflammation hos kroniskt och starkt patogenutsatta vilda möss. De enda cytokinsvar som var signifikant högre hos vilda möss än hos laboratoriemöss var IFN-γ-, IL-4- och MIP-2α-svar på anti-CD3/anti-CD28, vilket stämmer överens med de högre andelarna minnes- och effektor-T-celler hos vilda möss. Dessa resultat tyder på att medfödda cytokinsvar, och deras funktionella effekter, kan behöva omvärderas hos laboratoriemöss.