Möss

Alla djurförsök och allt arbete med musen godkändes av kommittén för djuromsorg och djuranvändning vid Kinas lantbruksuniversitet (tillståndsnummer: SKLAB-2016-01-04). CD1- och 129-möss erhölls från Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Actin-GFP-möss erhölls från Shaorong Gaos laboratorium vid Tongji University. Alla möss hölls under specifika patogenfria (SPF) förhållanden med en 12-timmars mörker/ 12-timmars ljuscykel mellan 06:00 och 18:00 i ett temperaturkontrollerat rum (22 ± 2 °C) med fri tillgång till vatten och mat.

Stemcellinjer och cellkultur

G4 och G4-ACTB-DsRed-MST ESCs erhölls från Dr. Andras Nagy, Kristina Vintersten och Marina Gertsensteins laboratorium vid Mount Sinai Hospital & Samuel Lunemfeld Research Institute. Blimp1-mVenus och Stella-ECFP (BVSC) dubbeltransgen ESC-linje, som uttrycker membranriktad Venus (mVenus) under kontroll av Prdm1 (Blimp1) reglerande element och förstärkt CFP (ECFP) under kontroll av Dppa3 (Stella/Pgc7), erhölls från Dr Mitinori Saitou45,46.

För att generera Lefty1-mCherry mus XEN-cellinjen användes Lefty1-promotorn och det fluorescerande proteinet för att integreras i XEN-celler med hjälp av Sleeping Beauty-transposonsystemet, som består av två komponenter: transposonvektorn som modifierats från pT2/LTR7-GFP (addgene#62541) och transposasvektorn (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879). PT2/LTR7-GFP tillsattes med ”puro” castle, som kunde uttrycka puromycin N-acetyltransferas och GFP CDS-regionen ersattes med mCherry. DNA-fragmentet, som amplifierades från pT2/LTR7-GFP med primer PT2-F (GTTTGGACAAACCACAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACACATCATTTTCTG), kopplades ihop med ”puro”-slottet och mCherry CDS-regionen för att erhålla vektorn PT2-Puro-mCherry med hjälp av NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs). Promotorsekvensen för Lefty1-genen amplifierades från DNA från ES-celler av mus med Lefty1-F (GTCCGGTGGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTCTTGAGGTCTCTGCGG). Sedan lades promotorsekvensen för Lefty1-genen till PT2-Puro-mCherry med hjälp av NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs), där PT2-Puro-mCherry linjäriserades med EcoRI och överlappningssekvensen som innehåller EcoRI-sekvensen lades till promotorsekvensen för Lefty1-genen. Vektorn fick namnet PT2-Puro-mCherry-Lefty1. Därefter transfekterades PT2-Puro-mCherry-Lefty1 och pCMV(CAT)T7-SB100 i mus XEN-celler och screenades med 2 μg per mL puromycin för efterföljande analyser.

För generering av Lamc1 (laminin, gamma 1) knockout-cellinjer användes två sgRNA-sekvenser (GGAGTACTGCGCGTGCAGACTGGGGGG och GCTTTGCCACCAGGTGGTGTGTCGG) som är riktade mot Lamc1:s exon1 för att konstruera en dubbel sgRNA-vektor. Fragment som innehåller två sgRNA-sekvenser amplifierades från PUC-U6-sgRNA-Kana (från Huang Xingxu lab) med hjälp av primers (Lamc1sg1-F: atgcgtctcacaccggagtactgcgtggcagactggttttagagagctagaaatagcaag och Lamc1sg2-R: atgcgtctcgaaacacacaccacctggtggggcaaagcgtgttgtttcgtcctttccacaag). PCR-produkten smältes med BsmbI och ligerades med linjäriserad PX330-GFP. Vektorerna har transfekterats i ESCs och XENCs med hjälp av Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Därefter sorterades GFP-positiva celler med hjälp av flödescytometri och späddes för monoklonal tillväxt. DNA extraherades från de erhållna monoklonala cellerna och utsattes för PCR-amplifiering och sekvensering. Knockout-positiva celler valdes ut för uppföljningsexperiment.

För generering av Nodal knockout-cellinjer användes gRNA-sekvenser med inriktning på (GCCCTCGTCACCGTCCCCCCTCTGG) Nodals exon1 för att konstruera sgRNA-vektorn. Primerna för Nodal sgRNA (Nodal-sgF: caccgccctcgtcaccgtcccctc och Nodal-sgR: aaacgaggggacggtgacgagggc) glödde och den glödgade produkten ligerades till linjäriserad PX330-GFP med BbsI. Vektorerna har transfekterats i ESC med Lipofectamine 3000 och GFP-positiva celler sorterades med hjälp av flödescytometri och späddes för monoklonal tillväxt. DNA extraherades från de erhållna monoklonala cellerna och utsattes för PCR-amplifiering och sekvensering. Knockout-positiva celler valdes ut för uppföljningsexperiment.

För generering av p53 knockout ESC-linje klonades sgRNA-sekvensen för p53-mutation in i vektorn PX330-GFP (addgene, #48138) med hjälp av CRISPR-Cas9-systemet59. Vektorn transfekterades i G4 ESCs med Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Tre dagar efter transfektionen sorterades GFP-positiva celler och plattades ut på en 6-hålsplatta. Kolonier plockades och knockout-regionerna amplifierades genom PCR med hjälp av primers (F: CATCCAGGGCGGGAAATAGAGAC; R: CCTGACTGTGTGTGTAAACTAGGC) och sekvenserades. Genom att anpassa sig till vildtypsekvensen identifierades homozygota knockoutcellkolonier och valdes ut för vidare studier.

ESC odlades i Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) med 15 % (v/v) FBS (Gibco, ES-cellkvalificerad), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM icke-essentiella aminosyror (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natriumpyruvat (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1 % penicillin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1 000 IU LIF (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM PD0325901 (4423, Tocris) och 3 µM CHIR99021 (4192, Tocris). ESC odlades vid 37 °C och 5 % CO2 på gelatiniserade och feeder-täckta vävnadskulturbrunnsplattor, och passerade när 80 % konfluens uppnåddes.

TSC härstammade från E3,5 blastocyster som spolades från livmodern hos en 5 veckor gammal CD1-mushona15,60. Blastocysterna odlades på mitotiskt inaktiverade mus MEF-celler (feederceller) med TSC-kulturmedium: avancerat RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) kompletterat med 20 % (v/v) FBS (Gibco, kvalificerad för ES-celler), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natriumpyruvat (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1 % (v/v) penicillin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng per mL rekombinant human FGF4 (235-F4-025, R&D) och 1 µg per mL heparin (07980, Stem Cell). Fram till dess att utväxten bildades på dag 4, disaggregerades de därefter genom att inkuberas i 0,1 % trypsin-EDTA i 5 minuter i inkubatorn. Tillsätt färskt mus 70 % embryonala fibroblastkonditionerat medium innehållande FGF4 och heparin för att stoppa reaktionen och återgå till inkubatorn. Byt ut mediet varannan dag tills TS-cellkolonier kan observeras, och byt ut mediet mot TSC-kulturmedium för att bibehålla cellerna. TSC-cellinjer som uttrycker EGFP (TSC-EGFP) härstammade från TSC av vildtyp som transfekterades med vektorn PB-UBC-EGFP med JetPrime (114-15, Polyplus transfection). TSC odlades vid 37 °C och 5 % CO2 på gelatiniserade och feedertäckta vävnadskulturbrunnsplattor av hög kvalitet och passerade när 80 % konfluens uppnåddes. Odlingsmediet byttes dagligen.

XENCs härstammade från E3.5-blastocyster som spolades från livmodern hos fem veckor gamla 129-mushonor med hjälp av modifierade XENC-förhållanden61. Musens blastocyster odlades på matarceller tills de bildade en utväxt på dag 4 som därefter splittrades genom inkubation i 0,1 % trypsin-EDTA i 5 minuter i inkubatorn. Tillsätt färskt mus ES-cellmedium utan PD0325901 och CHIR99021 för att stoppa reaktionen och byt ut mediet varannan dag tills XEN-cellkolonier kan observeras. XEN-cellkolonier upprätthölls med standard XEN-medium: avancerat RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) kompletterat med 15 % (v/v) FBS (Gibco) och 0,1 mM β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 % penicillin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific). XENC-EGFP-cellinjen härstammade direkt från Actin-EGFP-musblastocysten. För matningsfri odling hölls XENC- cellerna på en brunnsplatta av vävnadskulturkvalitet belagd med gelatin. XEN-cellerna odlades vid 37 °C och 5 % CO2. Passerades när de nådde 90 % konfluens. Odlingsmediet byttes dagligen.

Generering av självmonterade embryon

ESCs, som nådde 80 % konfluens, tvättades en gång med PBS (14190-094, Gibco) och inkuberades i 5 minuter vid 37 °C i TrypLE (12605010, Thermo Fisher Scientific). TSC och XENC separerades till enskilda celler genom inkubation med 0,1 % trypsin-EDTA (25300054, Thermo Fisher Scientific) vid 37 °C. Cellerna pelleterades genom centrifugering vid 1000 rpm i 5 minuter. Pelleten återuppsuspenderades i rekonstruerat embryomedium genom att pipettera till enskilda celler. Cellerna räknades automatiskt med en automatisk cellräknare.

För ETX-embryoider blandas ESC, TSC och XNEC med ett cellantal på 1 × 105, 1 × 105 respektive 2 × 105 (för ETS-embryoider blandas ESC och TSC med ett cellantal på 1 × 105 respektive 1 × 105); för EXE-embryoider, blanda ESC:er och XENC:er med ett cellantal på 1 × 105 respektive 1 × 105) med 2 ml rekonstruerat embryomedium per 35 mm obehandlad cellodlingsskål. Flytta skålen på horisontella rotatorer vid 37 °C, 5 % CO2 och 100 % luftfuktighet. Rotationshastigheten är 60 varv per minut. Det rekonstruerade embryomediet innehåller 39 % avancerat RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) och 39 % DMEM (11960069, Thermo Fisher Scientific) kompletterat med 17,5 % FBS (Gibco, ES-cellkvalificerat), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-mercaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM MEM icke-essentiella aminosyror (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natriumpyruvat (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1 % penicillin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific). Byte av medium med 2 mL färskt rekonstruerat embryomedium varje dag.

EXE-embryoider bildades konsekvent och effektivt, de funktionella experimenten kan utföras utan urval av regelbundna eller oregelbundna strukturer. För de funktionella experimenten med ETX-embryoider och ETS-embryoider valde vi ut de regelbundna strukturerna utifrån deras morfologi och lämpliga proportioner och positioner för ESC- och TSC-kompartmenten genom indikation av TSC-EGFP i stereofluorescensmikroskop.

Rekonstruktion av embryon av vildtyp och in vitro-odling

Blastocyster återställdes från E4,5 superovulerade dräktiga honmöss genom uterusspolning med M2 (MR-015-D, Millipore). Odling av embryon i IVC-medium efter avlägsnande av den murala trophektodermen in vitro på μ-slides med 8 hål (80826, Ibidi)62. För återvinning av E5,5, E5,75 och E6,5 embryon, dissektion av decidua från livmodern enligt det rapporterade protokollet63. För EPI-explantat från CD1-möss dissekerades på dag E5,0 enligt tidigare rapport28 och odlades med ETX-embryoidmedium in vitro.

Immunofluorescensfärgning

Musembryon och rekonstruerade embryon fixerades med 4 % paraformaldehyd (DingGuo, AR-0211) vid 4 °C i 20 minuter och tvättades tre gånger med en tvättbuffert (PBS innehållande 0,1 % Tween-20). Därefter permeabiliserades embryona med 0,5 % Triton X-100 (H5142, Promega) i 30 minuter i rumstemperatur och inkuberades med primära antikroppar i blockeringsbuffert (3 % BSA, 0,3 % Triton X-100) över natten vid 4 °C. Efter att ha tvättats för att avlägsna obundna primära antikroppar inkuberades cellerna med sekundära antikroppar i blockeringsbuffert över natten vid 4 °C. Cellkärnan färgades med DAPI, följt av två tvättar med tvättbuffert och monterades sedan i Fluoroshield Mounting Medium med DAPI (104140, abcam). Bilderna togs med ett Nikon A1 konfokalmikroskop.

Bilder med bearbetning och analys

Bilder för musembryon och rekonstruerade embryon togs med ett Nikon A1 konfokalmikroskop med ett 20 × eller 40 × objektiv. Alla analyser utfördes med hjälp av bildanalysprogramvara med öppen källkod ”Fiji”. Vävnadernas volym och cellantal för rekonstruerade embryon och vildtypembryon uppskattades och immunofluorescensintensitetsmätningar för PCX-fördelningsanalys utfördes också med hjälp av Fiji-programvaran9.

High-throughput single-cell qPCR och databehandling

För isolering av enskilda celler samlades vissa celler vid olika utvecklingsstadier (0, 24 och 84 timmar) in från två typer av ETX-embryoider, som rekonstruerades med Lefty1-mCherry XENC (LC-ETX-embryoider) respektive BVSC ESC (BVSC-ETX-embryoider) reportercelllinjer. För att isolera de enskilda cellerna väljer vi endast LC-ETX-embryoider med DVE/AVE-liknande vävnader som identifieras genom asymmetriskt uttryck av mCherry-proteinerna, och väljer BVSC-ETX-embryoider med asymmetriskt uttryck av mVenus-proteinerna i ESC-kompartmentet nära gränsen mellan ESC- och TSC-kompartmentet. För LC-ETX-embryoider samlades 0, 24 och 84 timmars LC-negativa ESC-avledda celler (LC- XEN) samt 84 timmars positiva ESC:er (BVSC+ ES) från motsatt sida av LC- XEN. För BVSC-ETX-embryoider samlades 0, 24 och 84 timmars BV-negativa ESC-celler (BVSC- ES) samt 84 timmars positiva ESC:er (BVSC+ ES) från motsatt sida av BVSC- ES. Dessutom samlades enskilda celler från TSC-kompartmenten i ETX-embryoiderna som samlades med BVSC-ESCs vid 0, 24 och 84 h in baserat på EGFP-reporter.

För separering av enskilda celler inkuberades alla ETX-embryoider i 0,1 % trypsin-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, USA) i 5 minuter vid 37 °C och överfördes sedan till M2-medium (MR-015-D, Millipore). Efter försiktig upprepad munpipettering flera gånger isolerades enskilda celler med en findragen glasspets. I genomsnitt samlades 30-40 celler in för varje typ. Varje cell tvättades tre gånger i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (Invitrogen, Carlsbad, USA) innehållande 0,1 % BSA (Sigma-Aldrich, MO, USA) och placerades i en masterblandning för omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) för lysis, sekvensspecifik omvänd transkription och föramplifiering, enligt beskrivning i tidigare rapport64.

För utformning och validering av primers användes gener som reglerar differentiering av cellinjer (huvudsakligen från E3,5 till E6,5) och som deltar i dominerande signalvägar (t.ex, Wnt, Nodal signalväg) valdes ut, i enlighet med musens embryogenes. MRNA-sekvenserna för varje intresserad gen hämtades från NCBI och endast gemensamma regioner användes för gener med olika transkript. Gen-specifika qRT-primers utformades med Primer3-programvaran med en längd på 100-250 bp. Alla primers hade testats med hjälp av cDNA från musembryon (blandning av E5,5 och E6,5) för amplifieringseffektivitet och specificitet (listad i Supplementary Data 1).

Single-cell sekvensspecifik föramplifiering liknande tidigare rapport65. Totalt 96 primeruppsättningar sammanfördes till en slutkoncentration på 0,1 μM för varje primer. Enskilda celler som isolerats från embryon överfördes till sterila mikrorör som laddades med 5 μL RT-PCR-masterblandning innehållande 2,5 μL CellsDirect-reaktionsblandning (Invitrogen, Carlsbad, USA), 0,5 μL primerpool, 0,1 μL RT/Taq-enzym (Invitrogen, Carlsbad, USA) och 1,9 μL nukleasfritt vatten (Invitrogen, Carlsbad, USA) i varje rör. Rören frystes omedelbart på torris. Efter en kort centrifugering vid 4 °C placerades rören omedelbart i PCR-maskinen. Celllyses och sekvensspecifika omvända transkriptioner utfördes vid 50 °C i 1 timme. Därefter inaktiverades det omvända transkriptaset och Taq-polymeraset aktiverades genom upphettning till 95 °C i 3 minuter. Därefter genomgick cDNA i samma rör 20 cykler av sekvensspecifik amplifiering genom denaturering vid 95 °C i 15 s och annealing och förlängning vid 60 °C i 15 minuter. För att undvika avdunstning förvarades de resulterande produkterna vid -80 °C.

För kvantitativ PCR med hög genomströmning i mikrofluidik för enskilda celler validerades alla föramplifierade cDNA-produkter med hjälp av realtids-PCR-systemet (ABI 7500) med hjälp av den endogena kontrollgenen Actinb, och endast tröskelövergångsvärden (Ct-värden) inom 9-12 valdes ut för efterföljande experiment. Amplifierade prov från enskilda celler analyserades med SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX (Bio-Rad, Kalifornien, USA) och enskilda qPCR-primers i 96 × 96 dynamiska matriser på ett Biomark-system (Fluidigm, San Francisco, USA). Beräkningen av Ct-värdena utfördes med programvaran BioMark Real-Time PCR Analysis (Fluidigm, San Francisco, USA).

För databehandling och visualisering av data från enskilda celler konverterades alla råa Ct-värden som erhållits från BioMark-systemet till log2-relativa uttrycksnivåer genom att subtrahera värdena från det antagna bakgrunds-Ct-värdet på 26. Prover med lågt eller obefintligt uttryck av endogena kontrollgener (Actinb och Gapdh) uteslöts från efterföljande analyser. PLS-DA tillämpades på expressionsdata för att särskilja cellgrupper i olika ETX-embryoider med R-paketet mixOmics66. Hierarkisk klustring utfördes med hjälp av euklidiska avstånd, och dendrogrammen visades längs de radskalade värmekartorna med hjälp av paketet fluidigmSC. Box-plots och violinplots genererades med programvaran origin 8.6 och R.

BVSC ESC-Chimeric embryoproduktion

Vi producerade BVSC ESC-Chimeric embryon genom 8-cellig embryoinjektionsmetod med Piezo Micromanipulation67. För att säkerställa att värdembryona injicerades före komprimering samlade vi embryona i tvåcellsstadiet och odlade in vitro. För att få fram embryon i tvåcellsstadiet superovulerades fem veckor gamla honmöss genom intraperitoneal injektion av fem internationella enheter (IE) PMSG, följt av 5 IE HCG 46-48 timmar senare, och parades med hanmöss. Embryon i tvåcellsstadiet samlades in genom att spola äggledaren med M2 vid E1,5. Embryona tvättades i M2 (MR-015-D, Millipore) och överfördes sedan till 10 μL KSOM-droppar (MR-020P-5F, Millipore) täckta med mineralolja på en vävnadskulturskål. Embryona hölls vid 37 °C med 5 % CO2 i en inkubator.

Omkring 15 ES-celler injicerades i embryon i 8-cellsstadiet med hjälp av Piezo Micromanipulation67,68. Åtta veckor gamla CD1-honor parade med vasektomerade hanar användes som pseudodräktiga möss. Injicerade blastocyster överfördes till livmodern hos pseudopregnanta honor vid 2,5 dagar post coitum (dpc). Embryon i morulastadiet med injicerade ESC:er överfördes till ovidukten hos mottagare med 0,5 dpc. Vi överförde 14-16 embryon per mottagare. Vid E6,5 samlade vi in de chimära embryona från deciduae enligt beskrivningen ovan.

Embryoöverföring och utvärdering av implantation

Åtta veckor gamla CD1-honor som parats med vasektomerade hanar användes som pseudodräktiga möss. För rekonstruerade embryon överfördes 36 timmars rekonstruerade sfärer (ETX-, ETS- och EXE-embryoider) till livmoderhornen hos pseudopräktiga mottagande CD1-honmöss vid 2,5 dpc eller 3,5 dpc. Sexton till tjugo embryon överfördes per mottagare. Implantationsställena på dag 6,5 identifierades och räknades genom intravenös injektion av 100 μL 1 % Chicago Sky Blue-lösning. Längden och radien på varje decidua mättes med hjälp av ett bildanalysprogram, och volymen beräknades från dessa mätningar som V = πr2l.

HE-färgning och immunfärgning av implantationsställen

För att undersöka utvecklingspotentialen hos självmonterade embryon samlade vi in decidua från olika stadier, bland annat 48, 72 och 84 timmar efter transplantationen. Dessa rekonstruerade (ETX, EXE och ETS) embryoprover fixerades med 4 % paraformaldehyd över natten vid 4 °C, dehydratiserades med gradientalkoholer, överfördes till xylen och bäddades in i paraffin. Vi använde E5,5, E6,0 och E6,5 vildtypembryon som kontroll. Proverna skars till 5 μm tjocklek, färgades med hematoxylin och eosin och observerades i mikroskop. Deparaffinerade rehydrerade prover utsattes för värmeinducerad epitope retrieval i citratbuffert vid cirka 95 °C i en mikrovågsugn i 10 minuter, varefter de kyldes ner till rumstemperatur och sköljdes två gånger i PBS med 3 minuter genom två gånger. Permeabilisering utfördes med 0,5 % Triton X-100 i PBS i 20 minuter i rumstemperatur. Efter permeabiliseringen sköljdes proverna i PBS tre gånger (3 min vardera). Därefter blockerades proverna i 30 min med 5 % bovint serumalbumin (BSA) i PBS och inkuberades med primära antikroppar mot kanin anti-CK (ab9377, Abcam), kanin anti-COX2 (ab15191, Abcam), kanin anti-Laminin (L9393, Sigma), get anti-Gata4 (sc-1237, Santa Cruz) eller mus anti-PL1(sc-376436, Santa Cruz) vid 4 °C över natten. Följande dag tvättades skivorna tre gånger i PBS i 5 minuter och inkuberades med sekundära antikroppar i 30 minuter vid 37 °C. Sekundära antikroppar märktes med Alexa Fluorophore 488 eller 594 (Invitrogen). Därefter sköljdes sektionerna sex gånger i PBS i 5 minuter vardera och monterades med Fluoroshield-monteringsmedium med DAPI (ab104140, Abcam). Objektglasen förvarades vid -20 °C tills de observerades. Bilderna togs med ett Leica fluorescerande mikroskop.

In situ-hybridisering

In situ-hybridisering med digoxygenin (DIG) utfördes på kryosektioner52. Musspecifika cRNA-prober för Dtprp användes för hybridisering. Sektioner som hybridiserades med senseprober fungerade som negativa kontroller. Frysta sektioner (8-10 μm) fästes på poly-l-lysinbelagda objektglas (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, Kina) och förvarades vid -80 °C tills de används. Sektionerna placerades på en diabildervärmare (37 °C) i 2 minuter och rehydrerades sedan i PBS, postfixerades i 4 % PFA i 15 minuter vid 4 °C, behandlades med proteinas K (15 μg per mL i 5 minuter vid rumstemperatur), acetylerades till 0,25 % i 10 minuter och hybridiserades med DIG-märkta prober över en natt vid 65 °C. Två tvättar efter hybridisering vid 65 °C genomfördes följt av två tvättar i 1 × MABT och 30 min RNasbehandling (20 μg per mL) vid 37 °C. Sektionerna blockerades i 1 timme och inkuberades över natten i block med anti-DIG-antikropp (1:2500, Sigma-Aldrich). Efter tvättning utvecklades färgen med NBT/BCIP tills en brun utfällning var synlig. Objektglasen kontrafärgades med nuclear fast red, dehydratiserades och klarades i xylen och monterades i cytoseal mounting medium. Fotografierna togs omedelbart innan INT/BCIP-utfällningen bleknade.

Genotypidentifiering av de överförda självmonterade embryona

Genomiskt DNA extraherades från DsRed-ESCs, EGFP-TSCs och ETX-embryoider som isolerats från decidua-vävnader med hjälp av ett TIANamp Micro DNA-kit (DP316, Tiangen) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Den diagnostiska primeruppsättningen EGFP (5ʹ-AGGACGTCATATCAAGGAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATAGTCTTCTTCTTCTG-3ʹ) och DsRed (5ʹ-GTGCTTCAGCCGCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCTCACCTCTTGATGCCGTTCT-3ʹ) användes för att identifiera cellernas och provernas region genom PCR. Den termiska profilen var 95 °C i 5 min, 35 cykler av 95 °C i 30 s, 60 °C i 30 s och 72 °C i 20 eller 40 s, och en sista cykel vid 72 °C i 5 min.

Statistik

Statistiska analyser bearbetades på programvaran GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA) för Windows (inklusive Log2-uttrycksdata för enstaka celler). Data hade kontrollerats för normalfördelning och lika varianser med F-test innan varje parametriskt statistiskt test utfördes. Vid behov utfördes tvåsidiga Student’s t-test med Welch’s korrigering om variansen mellan grupperna inte var lika stor. Felstaplarna representerar standardfelet för s.e.m. eller s.d. enligt specifikation. I figurens legend anges antalet oberoende experiment som utförts i varje analys. Varje experiment hade upprepats för reproducerbarhet.

Vävnadsvolym (figurerna 1i och 7c samt kompletterande figur 4h), beräkning av procentandelar och antal (figurerna 2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m och 7n; kompletterande figurer 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a och 12g) bestämdes med Excel. Signifikansanalysen utfördes med hjälp av t-test i GraphPad Prism. Stapeldiagram ritades med Excel och GraphPad Prism, och scatterplots ritades med GraphPad Prism.

Rapporteringssammanfattning

Förlängre information om den experimentella utformningen finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till den här artikeln.