V této studii, jsme zkoumali souvislost mezi 3′UTR SNP genů zapojených do transportu léčiv FAC, metabolismu, regulace detoxikačních drah, jaderných receptorů, klinických parametrů a celkové odpovědi na chemoterapii FAC. Výsledky naznačují, že riziko úmrtí, progrese onemocnění nebo recidivy karcinomu prsu je modifikováno genetickými variantami jaderných receptorů (NR1/2, PGR), genů zapojených do hlavní metabolické dráhy doxorubicinu (SLC22A16) a genu souvisejícího s doxorubicinem-progesteronem (AKR1C3). SNP v rámci genů DPYD a ALDH5A1 byly významně spojeny se zvýšením rizika RFS a analýzami odpovědi na léčbu/TFFS. Klinické prognostické faktory, které v naší studii ovlivňovaly přežití a léčebnou odpověď, se seskupily do tří kategorií – složky TNM stagingu u OS a PFS, stav nádorového progesteronového receptoru u RFS a léčebné odpovědi/TFFS a provedení chirurgických zákroků (bez ohledu na jejich rozsah) u analýz léčebné odpovědi/TFFS.

Rodina PXR hraje regulační funkci ve vztahu k enzymům I. fáze (enzymy cytochromu P450 CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9 a CYP2C19), enzymům II. fáze (UGT1A1, UGT1A2, SULT2A) a transportérům III. fáze (ABCB1, OAT, MRP3)37,38,39,40,41,42 . 3′UTR pregnanového receptoru X (NR1/2/PXR2), klíčové součásti xenobiotického senzoru, jsou cílem přítomnosti několika mikroRNA, včetně miR-362-5p, miR-500b-5p a miR-501-5p, což naznačuje význam epigenetické regulace exprese NR1/221 . Naše pozorování korelace mezi genetickou variantou 3′UTR uvedeného genu a přežíváním pacientů toto tvrzení zřejmě podporují, nicméně přesná geneticko-klinická souvislost musí být ještě potvrzena. Reuter a jeho kolegové takovou korelaci hledali, a přestože prokázali vliv polymorfismů NR1/2 na expresi proteinu ve vzorcích krve a tkáně pacientů s dlaždicobuněčným karcinomem hlavy a krku (HNSCC), nepodařilo se jim prokázat jejich vliv na celkovou dobu přežití43.

Nehledě na rozporuplnost výsledků výzkumu je pravděpodobné, že genetické varianty v rámci NR1/2, které ovlivňují expresi nebo aktivitu proteinu, mají významné klinické účinky různého charakteru38. SNP v kódující sekvenci genu NR1/2 korelovaly s rizikem vzniku celkové rakoviny44, progrese AIDS45, byly potenciálním rizikovým faktorem lékové rezistence u epilepsie46 a také hematologické toxicity vyvolané irinotekanem u pacientů s kolorektálním karcinomem47. Genetické varianty v oblasti 3′UTR NR1/2 ovlivňují transport, lokalizaci a stabilitu NR1/2 mRNA14,40. Několik studií potvrdilo vliv SNP 3′UTR NR1/2 na účinky léčby s následným zvýšením rezistence k chemoterapii také u pacientek s karcinomem prsu39,40,41,42. Skupina Olesona spojila rs3732359 a rs3732360 NR1/2 s vyšší aktivitou CYP3A in vivo. CYP3A4 je hlavním enzymem metabolizujícím léčiva a následným efektorovým genem NR1/2. Oleson a spol. dále zjistili, že varianty rs3732359 a rs3732360 NR1/2 vykazují vyšší medián perorální clearance midazolamu ve srovnání s homozygotními referenčními genotypy pro tyto SNP38. V naší skupině pacientů byla přítomnost rs3732359 AA NR1/2 nezávislým prediktorem OS. V univariačních analýzách představují nositelé genotypu AA téměř dvojnásobné zvýšení rizika úmrtí ve srovnání s pacienty s rs3732359 NR1/2 AG/GG. Toto pozorování naznačuje souvislost rs3732359 AA NR1/2 s horší prognózou přežití u žen s karcinomem prsu léčených chemoterapií FAC. Pozorování podobné našemu bylo zaznamenáno ve studii Swart et al. kde rs3732359 alela A NR1/2 rozlišovala pacientky do podskupin podle disproporce léků a odpovědi na léčbu21. Tento výsledek byl ve shodě s pozorováním Chew et al. že rs3732359 NR1/2 byla spojena s významným snížením nadiru hemoglobinu, trombocytů a/nebo absolutního počtu neutrofilů (ANC) oproti výchozí hodnotě v 1. cyklu, a to buď v závislosti, nebo nezávisle na vlivu na farmakokinetiku docetaxelu u pacientů s karcinomem nosohltanu48. Tyto výsledky naznačují vliv rs3732359 na hematopoetickou kapacitu kostní dřeně a schopnost zapojit detoxikační mechanismy v přítomnosti xenobiotik.

V naší studii byla zjištěna jasná asociace polymorfismů v rámci genu SLC22A16 zapojeného do transportu doxorubicinu s rizikem úmrtí a progrese onemocnění. Ota et al. a Faraji et al. poukázali na to, že polymorfismy v rámci SLC22A16 ovlivňují systémovou farmakodynamiku chemoterapie založené na doxorubicinu49,50 . V naší studii mají nositelé rs7756222 CC a rs9487402 TG/GG SLC22A16 snížené OS. Varianta rs7756222 CC SLC22A16 byla navíc nezávislým faktorem zkracujícím PFS. Naše výsledky jsou v souladu s výsledky Lal et al. 2007, že SNP v SLC22A16 jsou spojeny s kratším OS a PFS u asijských pacientek s karcinomem prsu51. Dřívější studie navíc potvrdily souvislost SNP v rámci SLC22A16 s toxickými vedlejšími účinky při chemoterapii u pacientek s karcinomem prsu36,50,52. Kromě toho je nadměrná exprese SLC22A16 v nádorových buňkách spojena se zvýšeným přísunem doxorubicinu do buňky a koreluje se zvýšenou citlivostí na cytotoxické účinky tohoto léčiva53. U pacientů s karcinomem žaludku upregulace SLC22A16 nezávisle předpovídala špatné OS a RFS u časného karcinomu žaludku a špatné OS u pokročilého karcinomu žaludku54. Kunii et al. také prokázali, že SLC22A16 je mediátorem vychytávání platiny v nádorových buňkách a down-regulace SLC22A16 je pravděpodobně jedním z mechanismů rezistence vůči cisplatině u karcinomu plic55. Citované zprávy potvrzují, že genetické varianty v rámci genu SLC22A16 ovlivňují účinnost importu chemoterapeutik do buňky, přičemž toxicita vyvolaná změněnou hladinou léčiva v buňce koresponduje s nejhorší odpovědí na léčbu.

Prezentujeme dva nezávislé genetické prognostické faktory, které významně ovlivnily riziko zkrácení PFS (rs1824125 GG a CC rs11224560 PGR) a RFS (rs3209896 AG AKR1C3) u pacientek s karcinomem prsu. Podle našich znalostí se jedná o první zprávu o potenciální interakci jak rs1824125 GG a rs11224560 CC progesteronového receptoru, tak rs3209896 AG AKR1C3 (gen související s progesteronem) s přežitím a odpovědí na léčbu. Bohužel funkční údaje pro rs1824125 a rs11224560 PGR chybí, ale pozice studovaných variant v regulačních sekvencích genu poukazuje na jejich předpokládanou roli v řízení exprese. Je všeobecně známo, že řízená exprese progesteronového receptoru je klíčová pro vývoj prsní tkáně, tím spíše, že gen PGR má dva promotory a translační startovací místa a produkuje dvě izoformy, PR-A a PR-B. PR-B je pozitivním regulátorem účinků progesteronu, ale PR-A antagonizuje účinky PR-B56. Vyvážená exprese obou izoforem PR je nutná pro zachování funkce mléčné žlázy a jakákoli nerovnováha je spojena se zvýšeným rizikem vzniku rakoviny prsu. V této souvislosti bylo prokázáno, že změněná rovnováha PR-A a PR-B narušuje účinky progesteronu na buňky prsu, a tím zvyšuje riziko vzniku karcinomu prsu57.

V této studii jsme prezentovali možný vztah mezi rizikem lokální recidivy a variantou rs3209896 AG v AKR1C3. AKR1C3 je enzym fáze I metabolizující léky, který se podílí na rezistenci vůči chemoterapeutikům včetně doxorubicinu58. Hraje významnou roli při deaktivaci doxorubicinu na doxorubicinol, méně aktivní metabolit59. Polymorfismy v AKR1C3 byly studovány jako rizikové faktory rakoviny plic, prostaty60, lymfomu61 a močového měchýře62. Existují také zprávy týkající se role variability AKR1C3 v riziku progrese onemocnění a úmrtnosti u B-buněčného nehodgkinského lymfomu63 a také v modulaci toxicity léčby a doby přežití u pacientek s karcinomem prsu58. Vlivem polymorfismu rs3209896 na riziko rakoviny a odpověď na chemoterapii se však zabývaly pouze dvě předchozí studie, avšak bez úspěchu. V první z nich u asijských pacientek s karcinomem prsu léčených chemoterapií obsahující doxorubicin nebyla prokázána žádná souvislost mezi rs3209896 AG AKR1C3 s chemotoxicitou, PFS a OS58. Ve druhé studii genetické analýzy matek a potomků genu AKR1C3 neodhalily souvislost rs3209896 AKR1C3 ve vztahu k riziku dětské leukémie61. V naší studii naopak geneticko-klinická souvislost týkající se výsledku u pacientek s karcinomem prsu léčených režimem FAC obsahujícím doxorubicin existovala. Dřívější studie naznačovala, že AKR1C3 patří do rodiny genů souvisejících s progesteronem, které se podílejí na preceptorovém metabolismu progesteronu, a domnívala se, že je slabším aktivátorem PGR64. Vzhledem k těmto údajům naše výsledky dále zdůrazňují klinický význam progesteronových signálních drah. Studie Redinga a kol. ukázala, že odchylka v genech AKR1C2 a AKR1C3 může zvyšovat riziko vzniku rakoviny prsu u žen, které užívaly estrogen-progesteronovou terapii65. Předpokládanou roli v rakovině prsu založenou na enzymech AKR1C metabolizujících progesteron na 4-pregen popsali Ji et al. Tito autoři spekulovali, že ztráta AKR1C1 a AKR1C2, ale nikoli AKR1C3 u karcinomu prsu, vede ke sníženému katabolismu progesteronu, což v kombinaci se zvýšenou expresí PR může zvyšovat signalizaci progesteronu jeho jadernými receptory64.

V naší studii měly nositelky rs291593 CC DPYD vyšší riziko rekurence onemocnění. DPYD katabolizuje 5-fluorouracil (5-FU), který se běžně používá k léčbě solidních karcinomů66,67,68 a je také součástí režimu FAC. Snížení aktivity enzymu může vést k prodloužení poločasu 5-FU a ke zvýšení rizika toxicity závislé na dávce67,68,69,70 . SNP rs291593 CC DPYD byl popsán ve studii Kima a kol. zaměřené na distribuci alel u 150 korejských subjektů68. Bohužel nejsou k dispozici žádné literární údaje o vlivu rs291593 DPYD a korelaci s přežitím a odpovědí na léčbu.

Naposledy v námi analyzované skupině pacientů koreloval polymorfismus rs1054899 AG/AA ALDH5A1 s horší odpovědí na chemoterapii FAC. ALDH5A1 je součástí metabolické dráhy cyklofosfamidu. Deficit tohoto enzymu je vzácná autozomálně recesivní neurologická porucha, při níž závažný defekt enzymu související s mutací genu v cestě degradace GABA způsobuje postupné zvyšování hladiny GABA i kyseliny gama-hydroxymáselné (GHB)71,72,73,74,75 . Kromě neurotransmiterových drah se ALDH5A1 spolu s ALDH1A1 a 3A1 podílí na přeměně cyklofosfamidu a řídí detoxikaci aldofosfamidu na neaktivní karboxyfosfamid76. Všeobecně se uznává, že interindividuální rozdíly v tvorbě metabolitů cyklofosfamidu mohou být důsledkem polymorfismů v genech, které katalyzují metabolické reakce, a také změn v jejich expresi77. Ačkoli údaje týkající se přesného vlivu regulační odchylky 3′UTR genu ALDH5A1 na aktivitu cyklofosfamidu chybí, existují zprávy naznačující souvislost mezi expresí enzymu a prognózou léčby. Skupina Tian uvádí, že nízká exprese ALDH5A1 je vynikajícím prediktivním faktorem špatné prognózy u karcinomu vaječníků (OC) a může hrát zásadní roli při progresi karcinomu vaječníků. Pozitivní souvislost mezi expresí ALDH5A1 a prognózou byla zjištěna u pacientek s časným i pokročilým stadiem karcinomu vaječníků. U karcinomu vaječníků II/III stupně byla vysoká hladina mRNA ALDH5A1 spojena s lepším OS78. Studie provedené na čínských pacientech s epilepsií potvrdily, že rs1054899 genu ALDH5A1 může hrát roli ve farmakokinetice kyseliny valproové (VPA) s antikonvulzivními účinky79.

V našich analýzách byly zkrácené OS a PFS a vysoké riziko úmrtí a progrese důsledkem pokročilého onemocnění – velikost nádoru větší než 20 mm v největším rozměru (tj. složka T větší než T1), infiltrované regionální lymfatické uzliny (tj. složka N jiná než N0) a přítomnost vzdálených metastáz (M1). Tato pozorování jsou v souladu s tradičním vnímáním postupné progrese karcinomu prsu od malých, dosud nerozšířených nádorů k větším, agresivnějším80. Velikost nádoru (složka T) je považována za jeden z rozhodujících faktorů odpovědi na léčbu. Ve studii Goorce a spol.81 byla klinická velikost nádoru (cT) nejsilnějším prediktorem dosažení patologické kompletní odpovědi (pCR), chápané jako nepřítomnost reziduálního nádoru, ve skupině pacientek s karcinomem prsu po neoadjuvantní chemoterapii. V této studii měly vyšší stupně cT silně, signifikantně nižší míru pCR, a to nezávisle na stupni a stavu progesteronových, estrogenových receptorů a HER2. Také nejnovější, osmé vydání příručky Cancer Staging Manual82 potvrzuje, že celý systém TNM stagingu karcinomu prsu je odhadem celkového objemu nádoru, popsaného maximálním rozměrem nádorové masy, bez zahrnutí dalších malých satelitních ložisek obklopujících hlavní nádor83.

Přítomnost metastáz v regionálních lymfatických uzlinách je dalším uznávaným faktorem horší prognózy u pacientek s karcinomem prsu. Podle nejnovějších pokynů se klasifikace uzlin provádí na základě velikosti největšího nádorového ložiska a součtem infiltrovaných lymfatických uzlin vzniká konečná hodnota N82. Obecně se rozsah postižení uzlin odráží ve zhoršené prognóze pacientek, která se projevuje – mimo jiné – zkrácením doby přežití84. Stejně tak přítomnost, lokalizace a rozsah vzdálených metastáz jsou jednoznačně zodpovědné za špatnou prognózu, přičemž se odhaduje, že 90 % úmrtí souvisejících s karcinomem prsu je způsobeno metastatickým šířením85. Takto drastická korelace se projevila i v našich analýzách, kde byla přítomnost vzdálených metastáz nejsilnějším, rovněž statisticky, přežití snižujícím faktorem. Tato situace zřejmě odráží nesoulad mezi primárním a sekundárním nádorem, pokud jde o klinické a biologické vlastnosti, které mění míru léčebné odpovědi mezi těmito lokalitami. Existují také komplikované zákonitosti, které spojují metastatické šíření s lokalizací primární masy, věkem pacientů a také s nepředvídatelným dopadem chirurgických zákroků na hlavní nádorovou masu, což může posílit růst spících mikrometastáz v různých orgánech85.

V naší studii byl negativní stav progesteronového receptoru u karcinomu prsu určující pro vysoké riziko recidivy, kratší TFFS a nedostatečnou odpověď na léčbu. Stav PR, estrogenových receptorů (ER) patří mezi biologické faktory, kromě exprese HER2 a grade, které byly začleněny do systému stagingu karcinomu prsu. Cílem takového přístupu bylo spojit nejnovější biologické poznatky s aktuálním klinickým výzkumem v naději na vytvoření jednoduchého, ale přesného stagingového vodítka, které by co nejpřesněji definovalo prognózu86. Nedostatečná exprese progesteronových receptorů u karcinomu prsu byla v posledních letech opakovaně uváděna jako faktor špatného výsledku léčby, což je v souladu s našimi výsledky. V práci Purdieho a dalších se ve skupině PR negativních pacientek, dokonce i v podskupině, která by jinak měla dobrou prognózu – tj. ER pozitivní a bez infiltrace lymfatických uzlin, významně zkrátilo pětileté specifické přežití u karcinomu prsu, a to s aplikací chemoterapie i bez ní87. V citované práci byla exprese PR nezávislým prognostickým faktorem, silnějším než stav ER. Podobné výsledky přinesla i studie van Mackelenbergha et al, kde ER-pozitivní/PR-negativní karcinomy prsu vykazovaly lepší počáteční odpověď na léčbu, i když nakonec bylo dlouhodobé přežití po neoadjuvantní chemoterapii významně zkráceno88. Složitost vlivu stavu hormonálních receptorů na výsledek léčby by mohla vyplývat ze zkřížených mechanismů existujících mezi estrogenovými a progesteronovými receptory. Když PR chybí, estrogenový receptor rekrutuje specifické kofaktory a váže se na elementy estrogenové odpovědi v chromatinu. Výsledkem je aktivace drah, které vedou k buněčné proliferaci89. Takové vzájemné ovlivňování bylo ilustrováno v práci Mohammeda a spol.90 , kteří poukázali na to, že u karcinomu prsu PR moduluje chování ER a jeho exprese může být považována za marker funkce ER.

Analýzy genetických a klinických faktorů by mohly být užitečné při pokusu o vytvoření komplexních kombinovaných geneticko-klinických modelů pro předvýběr pacientek do jednotnějších skupin s podobnou prognózou s ohledem na úmrtí, progresi onemocnění, recidivu, rozvoj metachronního karcinomu prsu a celkovou odpověď na léčbu. Za tímto účelem jsme provedli kumulativní analýzy a vybrali skupiny pacientek se zdánlivě nejhorší prognózou, které v daném prostředí nesly nejvyšší počet nepříznivých faktorů. U každé z analýz klinická složka poukazovala na pokročilost onemocnění. Obraz byl dále doplněn o genetické modifikátory. Vzhledem k častému nedostatku údajů o přesném vlivu studované genetické varianty na funkci genu nebo proteinu je třeba každou interpretaci kumulativního modelu provádět s velkou opatrností. Nicméně OS a nejvyšší riziko úmrtí bylo zřejmým důsledkem pokročilých stadií TNM, ale přítomnost dvou variant v transportéru doxorubicinu SLC22A16 v tomto modelu zdůrazňují význam optimálního přísunu léčiva do buněk. Kromě toho se zdá, že aktivita hlavního detoxikačního přepínače NR1/2 v modelu OS hraje roli při zprostředkování rizika úmrtí. Lze předpokládat, že horší léčebná odpověď v tomto ohledu může být odrazem hyperaktivních detoxikačních cest některého z léčiv FAC, které snižují terapeutickou koncentraci léčiv. Je třeba poznamenat, že sílu tohoto modelu dále zvyšuje absence výskytu úmrtí ve skupině nenositelů vysoce rizikových faktorů.

Skupina s nejhorší prognózou, pokud jde o progresi rakoviny, se rovněž vyznačovala pokročilostí onemocnění (metastázy) a polymorfní variantou v genu SLC22A16 pro importér doxorubicinu. V tomto modelu však obraz dotvářela přítomnost dvou SNP v genu pro progesteronový receptor. Tento „dvojitý zásah“ jako takový, podobně jako v případě SLC22A16 v analýze OS, poukazuje na vztahy mezi fyziologickými, metabolickými a signálními cestami progesteronu a metastatickou schopností buněk karcinomu prsu, stejně jako na oživení spících mikrometastáz. Signální cesty progesteronu, vnímané jako negativní stav PR receptoru v nádorových buňkách, se ukázaly také jako součást nejhoršího scénáře v analýze přežití bez recidivy. V této situaci však bylo vysoké riziko recidivy současně závislé na modifikaci v katabolizátoru 5-fluorouracilu DPYD a také v AKR1C3, součásti metabolických mechanismů doxorubicinu i progesteronu. Tento výsledek opět zdůrazňuje význam progesteronové signalizace a aktivity detoxikačního mechanismu, který zajišťuje optimální terapeutickou koncentraci léčiv.

Podle našich znalostí se jedná o první studii, která hodnotí prognostickou hodnotu polymorfismů 3′UTR genů ADME v kontextu celkové léčebné odpovědi u karcinomu prsu. Klinické determinanty jako vysoce rizikové faktory však v této analýze převažovaly nad genetickými. Výsledky nepřekvapivě ukázaly, že PR negativita nádoru spolu s absencí chirurgických zákroků, která je zase přímým důsledkem špatného stavu pacientky, jsou prediktory negativních událostí, jako je úmrtí, progrese, recidiva a vznik dalšího karcinomu prsu. Jediná genetická složka v tomto modelu, varianta v ALDH5A1, poukazuje na mechanismy katabolismu cyklofosfamidu. Síla tohoto modelu je navíc podpořena výsledky analýzy TFFS. Zatímco původní léčebná odpověď byla v této práci odhadnuta do 10 měsíců od zahájení chemoterapie, získané rozdělení pacientek do skupin s ohledem na počet nepříznivých faktorů umožnilo předpovědět dlouhodobé přežití. V návaznosti na tuto analýzu uvádíme bezprecedentní, více než 14násobné snížení mediánu přežití mezi skupinami s nejlepší a nejhorší prognózou.

Závěrem lze říci, že normální zárodečné varianty běžně přítomné v populaci jsou důležitými faktory určujícími odpověď na léčbu. Studie ukazuje, že polymorfismy jsou nezávislým prognostickým faktorem předpovídajícím přežití u žen s karcinomem prsu. Dále jsme pozorovali vliv kumulace více nepříznivých genetických a klinických faktorů na špatnou prognózu přežití a celkovou odpověď na léčbu. Výsledky naznačují, že zárodečné polymorfismy ovlivňují farmakokinetiku doxorubicinu. Naše studie naznačuje nejsilnější asociace mezi celkovým přežitím, přežitím bez progrese a genetickými polymorfismy v genu SLC22A16 zapojeném do transportu doxorubicinu. SNP v genu AKR1C3, který se podílí na dráze metabolismu doxorubicinu, má navíc vliv na přežití bez recidivy. Souhrnně lze říci, že přítomnost nepříznivých genetických a klinických faktorů zvyšuje riziko špatného výsledku léčebné odpovědi u polských žen s karcinomem prsu, které byly léčeny režimem FAC. Tato studie naznačuje, že výběr pacientek na základě kumulativních modelů nepříznivých faktorů může být užitečný při předpovídání prognózy s ohledem na úmrtí, progresi nebo recidivu

.