Neste estudo, investigamos a associação entre os 3′UTR SNPs de genes envolvidos no transporte de drogas FAC, metabolismo, regulação das vias de desintoxicação, receptores nucleares, parâmetros clínicos e a resposta global à quimioterapia FAC. Os resultados sugerem que o risco de morte, progressão da doença ou recorrência do câncer de mama é modificado por variantes genéticas dos receptores nucleares (NR1/2, PGR), genes envolvidos na principal via metabólica da doxorubicina (SLC22A16) e gene relacionado à doxorubicina-progesterona (AKR1C3). Os SNPs dentro dos genes DPYD e ALDH5A1 foram significativamente associados com o aumento do risco de RFS e análises de resposta ao tratamento/TFFS. Os fatores de prognóstico clínico que influenciaram a sobrevivência e resposta ao tratamento em nosso estudo se agruparam em três categorias – os componentes do estadiamento de TNM em OS e PFS, o estado do receptor de progesterona tumoral em RFS e resposta/TFFS, e a implementação de procedimentos cirúrgicos (independentemente de sua extensão) nas análises de resposta ao tratamento/TFFS.
A família de PXR desempenha uma função reguladora em referência às enzimas da fase I (citocromo P450 enzimas CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9 e CYP2C19), enzimas da fase II (UGT1A1, UGT1A2, SULT2A) e transportadores da fase III (ABCB1, OATs, MRP3)37,38,39,40,41,42. 3′UTR do receptor pregnante X (NR1/2/PXR2), um componente chave do sensor xenobiótico, são alvos para a presença de vários microRNAs, incluindo miR-362-5p, miR-500b-5p e miR-501-5p, o que sugere a importância da regulação epigenética da expressão NR1/221. Nossas observações sobre as correlações entre a variante genética 3′UTR do referido gene e a sobrevida dos pacientes parecem apoiar tal afirmação, porém a exata ligação genético-clínica ainda não foi confirmada. Reuter e colegas buscaram tal correlação e, embora tenham demonstrado um impacto dos polimorfismos NR1/2 na expressão proteica em amostras de sangue e tecidos de pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (HNSCC), não conseguiram demonstrar sua influência nos tempos de sobrevivência global43,
Independentemente da inconsistência dos resultados da pesquisa, é plausível que as variações genéticas dentro do NR1/2 que influenciam a expressão ou atividade proteica, tenham efeitos clínicos significativos de caráter diverso38. Os SNPs dentro da seqüência de codificação do gene NR1/2 têm se correlacionado com o risco de câncer em geral44, progressão da AIDS45, foram o fator de risco potencial de resistência a drogas na epilepsia46, bem como de toxicidade hematológica induzida pelo irinotecano em pacientes com câncer colorretal47. As variantes genéticas na região 3′UTR da NR1/2 afetam o transporte, a localização e a estabilidade do NR1/2 mRNA14,40. Diversos estudos confirmaram a influência do 3′UTR SNPs da NR1/2 sobre os efeitos do tratamento, com consequente aumento da resistência à quimioterapia também em pacientes com câncer de mama39,40,41,42. O grupo de Oleson associou rs3732359 e rs3732360 da NR1/2 com maior atividade de CYP3A in vivo. O CYP3A4 é a principal enzima metabolizadora de medicamentos e o gene efetor downstream do NR1/2. Além disso, Oleson et al. descobriram que as variantes rs3732359 e rs3732360 de NR1/2 exibiram maior clearance mediano de midazolam oral em comparação com genótipos homozigotos de referência para esses SNPs38. Em nosso grupo de pacientes, a presença de rs3732359 AA NR1/2 foi um preditor independente de OS. Em análises univariadas os portadores com genótipo AA apresentam um aumento de quase 2 vezes no risco de morte em relação aos pacientes NR1/2 rs3732359 AG/GG. Essa observação sugeriu associação de rs3732359 AA NR1/2 com pior prognóstico de sobrevivência em mulheres com câncer de mama tratadas com quimioterapia FAC. Observações semelhantes às nossas foram relatadas no estudo de Swart et al. onde o alelo A NR1/2 rs3732359 diferenciou as pacientes em subgrupos de acordo com a desproporção de fármacos e resposta terapêutica21. Este resultado foi concordante com as observações de Chew et al. que o rs3732359 NR1/2 foi associado a uma redução significativa da hemoglobina de nadir, plaquetas e/ou contagem absoluta de neutrófilos (ANC) da linha de base no ciclo 1, seja dependente ou independente dos efeitos sobre a farmacocinética do docetaxel em pacientes com câncer nasofaríngeo48. Estes resultados sugerem o efeito do rs3732359 na capacidade hematopoiética da medula óssea, e a capacidade de engajar mecanismos de desintoxicação na presença de xenobióticos.
Em nosso estudo houve uma clara associação de polimorfismos dentro do gene SLC22A16 envolvido no transporte de doxorubicina com o risco de morte e progressão da doença. Ota et al. e Faraji et al. empurraram que os polimorfismos dentro da SLC22A16 afetaram a farmacodinâmica sistêmica da quimioterapia baseada em doxorubicina49,50. Em nosso estudo, os portadores rs7756222 CC e rs9487402 TG/GG SLC22A16 diminuíram o OS. Além disso, a variante rs7756222 CC SLC22A16 foi o fator independente que encurtou o PFS. Nossos resultados são consistentes com os resultados de Lal et al. 2007, que os SNPs na SLC22A16 estão associados a SO e PFS mais curtos em pacientes asiáticos com câncer de mama51. Além disso, estudos anteriores confirmaram a associação de SNPs na SLC22A16 com efeitos colaterais tóxicos na quimioterapia em pacientes com câncer de mama36,50,52. Além disso, a superexpressão da SLC22A16 nas células cancerosas está associada ao influxo crescente de doxorubicina para a célula e correlaciona-se com o aumento da sensibilidade aos efeitos citotóxicos deste medicamento53. Em pacientes com câncer gástrico, a upregulação da SLC22A16 previu, de forma independente, OS e RFS pobres, em câncer gástrico precoce e OS pobres em câncer gástrico avançado54. Kunii et al. demonstraram também que a SLC22A16 é um mediador da captação de platina nas células cancerosas, e a desregulação da SLC22A16 é possivelmente um dos mecanismos de resistência contra a cisplatina no câncer de pulmão55. Os relatórios citados confirmam que as variantes genéticas dentro do gene SLC22A16 influenciam a eficácia de importação de drogas quimioterápicas para a célula, enquanto a toxicidade gerada pela mudança no nível da droga na célula corroborou com a pior resposta ao tratamento.
Apresentamos dois fatores prognósticos genéticos independentes que influenciaram significativamente o risco de PFS (rs1824125 GG e CC rs11224560 de PGR) e RFS (rs3209896 AG AKR1C3) em pacientes com câncer de mama. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relato das potenciais interações tanto do receptor de progesterona rs1824125 GG e rs11224560 CC quanto do receptor de progesterona rs3209896 AG AKR1C3 (gene relacionado à progesterona) com a resposta de sobrevivência e tratamento. Infelizmente, faltam os dados funcionais para os rs1824125 e rs11224560 do PGR, mas a posição das variantes estudadas nas sequências reguladoras do gene aponta para o seu papel suspeito no controlo da expressão. É sabido que a expressão controlada do receptor de progesterona é crucial para o desenvolvimento do tecido mamário, tanto mais que o gene PGR tem dois promotores e locais de início translacional e produz duas isoformas, PR-A e PR-B. O PR-B é o regulador positivo dos efeitos da progesterona, mas o PR-A antagoniza os efeitos do PR-B56. A expressão equilibrada de ambas as isoformas de PR é necessária para manter a função da glândula mamária e qualquer desequilíbrio está associado ao aumento do risco de câncer de mama. A este respeito, foi demonstrado que o balanço alterado de PR-A e PR-B distorce os efeitos da progesterona nas células mamárias, aumentando assim o risco de câncer de mama57,
Neste estudo apresentamos a possível relação entre o risco de recidiva local e a variante rs3209896 AG em AKR1C3. AKR1C3 é a enzima metabolizadora de drogas fase I implicada na resistência a quimioterápicos, incluindo doxorubicina58. Ele desempenha um papel significativo na desativação da doxorubicina para doxorubicinol, um metabólito menos ativo59. Os polimorfismos em AKR1C3 foram estudados como fatores de risco para pulmão, próstata60, linfoma61 e câncer de bexiga62. Há também relatos sobre o papel da variação de AKR1C3 no risco de progressão da doença e mortalidade no linfoma não-Hodgkin de células B63, bem como na modulação da toxicidade do tratamento e do tempo de sobrevida em pacientes com câncer de mama58. Entretanto, a influência do polimorfismo rs3209896 no risco de câncer e na resposta à quimioterapia foi considerada apenas em dois estudos anteriores, mas sem sucesso. No primeiro, pacientes asiáticos com câncer de mama tratados com quimioterapia contendo doxorubicina não mostraram correlação entre rs3209896 AG AKR1C3 com quimiotoxicidade, PFS e OS58. No segundo estudo, análises genéticas maternas e de descendentes do gene AKR1C3 não revelaram a associação do rs3209896 AKR1C3 em relação ao risco de leucemia infantil61. Em nosso estudo, a ligação genético-clínica em relação ao resultado em pacientes com câncer de mama tratados com regime de FAC contendo doxorubicina, por outro lado, existiu. Estudo anterior sugeriu que AKR1C3 pertence à família de genes relacionados à progesterona envolvidos no metabolismo pré-determinante da progesterona e acreditava ser um ativador mais fraco do PGR64. Dados estes dados, nossos resultados enfatizam ainda mais a importância clínica dos caminhos de sinalização da progesterona. Estudo realizado por Reding et al. mostrou que a variação nos genes AKR1C2 e AKR1C3 poderia aumentar o risco de câncer de mama entre mulheres que utilizaram a terapia com estrogênio-progesterona65. Um papel putativo no câncer de mama baseado nas enzimas AKR1C metabolizando a progesterona em um 4-pregneno foi descrito por Ji et al. Esses autores especularam que a perda de AKR1C1 e AKR1C2, mas não de AKR1C3 no câncer de mama, resultou na diminuição do catabolismo da progesterona que, em combinação com o aumento da expressão de RP, pode aumentar a sinalização da progesterona por seus receptores nucleares64,
Em nosso estudo os portadores de rs291593 CC DPYD tinham maior risco de recorrência da doença. O DPYD catabolizante 5-fluorouracil (5-FU), comumente utilizado para o tratamento de carcinomas sólidos66,67,68, é também o componente do regime FAC. A diminuição da atividade enzimática pode levar a um aumento da meia-vida do 5-FU e a um aumento do risco de toxicidade dose-dependente67,68,69,70. O SNP rs291593 CC DPYD foi descrito no estudo de Kim et al., que focou a distribuição de alelos em 150 sujeitos coreanos68. Infelizmente, não há dados da literatura sobre o efeito do SNP rs291593 DPYD e correlação com a sobrevida e resposta ao tratamento.
Por último, em nosso grupo de pacientes analisado o polimorfismo rs1054899 AG/AA ALDH5A1 correlacionou-se com pior resposta à quimioterapia FAC. O ALDH5A1 é um componente da via metabólica da ciclofosfamida. Uma deficiência dessa enzima é uma doença neurológica autossômica recessiva rara, na qual um grave defeito enzimático relacionado à mutação genética na via de degradação GABA causa uma elevação consecutiva tanto do GABA quanto do ácido gama-hidroxibutírico (GHB)71,72,73,74,75. Além das vias neurotransmitórias, a ALDH5A1, juntamente com a ALDH1A1 e 3A1, participam da transformação da ciclofosfamida, orientando a desintoxicação da aldofosfamida em carboxifosfamida inativa76. É amplamente aceito que diferenças interindividuais na formação dos metabólitos da ciclofosfamida podem resultar de polimorfismos em genes que catalisam reações metabólicas, bem como de mudanças em sua expressão77. Embora faltem os dados sobre o impacto exato da variação da regulamentação ALDH5A1 3′UTR na atividade ciclofosfamídica, há relatos sugerindo a conexão entre a expressão enzimática e o prognóstico do tratamento. O grupo de Tian relatou que a baixa expressão da ALDH5A1 é um excelente fator preditivo de mau prognóstico no câncer de ovário (OC) e pode desempenhar um papel crucial na progressão do câncer de ovário. A associação positiva entre a expressão da ALDH5A1 e o prognóstico foi encontrada em estágios iniciais e avançados de pacientes com câncer de ovário. Nos graus II/III de câncer de ovário, um alto nível de ALDH5A1 de mRNA foi associado à melhora do OS78. Estudos realizados em pacientes com epilepsia chinesa confirmaram que o rs1054899 do gene ALDH5A1 pode desempenhar um papel na farmacocinética do ácido valpróico (VPA) com propriedades anticonvulsivantes79.
Em nossas análises, o OS e PFS reduzidos, e o alto risco de morte e progressão, foram os resultados de doença avançada – tamanho do tumor acima de 20 mm em maior dimensão (ou seja, componente T maior que T1), linfonodos regionais infiltrados (ou seja, componente N diferente de N0) e a presença de metástases distantes (M1). Estas observações estão de acordo com a percepção tradicional da progressão gradual dos cancros mamários, desde pequenos tumores, ainda não disseminados, até tumores maiores e mais agressivos80. O tamanho do tumor (componente T) é visto como um dos fatores mais cruciais de resposta ao tratamento. No estudo de Goorts et al.81, o tamanho clínico do tumor (CT) foi o preditor mais forte para alcançar a resposta patológica completa (PCR), visto como a ausência de câncer residual, no grupo de pacientes com câncer de mama após a quimioterapia neoadjuvante. Neste estudo, as maiores etapas de cT apresentaram taxas de pCR fortes e significativamente menores, independentemente do grau e progesterona, receptores de estrogênio e status HER2. Além disso, a mais recente edição do Cancer Staging Manual82 confirma que todo o sistema de estadiamento do TNM para câncer de mama é a estimativa do volume total do tumor, descrito pela dimensão máxima da massa tumoral, sem a inclusão de pequenos focos satélites adicionais em torno do tumor principal83,
A presença de metástases linfonodais regionais é outro fator reconhecido de pior prognóstico em pacientes com câncer de mama. De acordo com as mais recentes diretrizes, a classificação dos nódulos é feita sobre o tamanho do maior depósito tumoral, e a soma dos linfonodos infiltrados resulta no valor final de N82. Geralmente, a escala de envolvimento dos nódulos se reflete no agravamento do prognóstico das pacientes, visto – entre outros – na redução do tempo de sobrevida84. Da mesma forma, a presença, localização e extensão das metástases distantes são inequivocamente responsáveis pelo mau prognóstico, estimando-se que 90% das mortes relacionadas ao câncer de mama sejam devidas à disseminação metastática85. Tal correlação drástica também foi observada em nossas análises, onde a presença de metástases distantes foi o fator mais forte, também estatisticamente estatisticamente, de redução da sobrevida. Esta situação parece refletir as discordâncias entre os tumores primários e secundários, em relação às características clínicas e biológicas que alteram a taxa de resposta ao tratamento entre esses locais. Além disso, existem padrões complicados ligando a propagação metastática com a localização da massa primária, a idade dos pacientes e também com o impacto imprevisto dos procedimentos cirúrgicos sobre a massa tumoral principal, o que pode aumentar o crescimento de micrometástases dormentes em diferentes órgãos85.
Em nosso estudo, o status negativo do receptor de progesterona no câncer de mama foi o determinante do alto risco de recidiva, menor TFFS e falta de resposta ao tratamento. O estado dos receptores de PR, estrogênio (ERs) estão entre os fatores biológicos, além da expressão e grau HER2, que tinham sido incorporados ao sistema de estadiamento do câncer de mama. O objetivo desta abordagem foi combinar os conhecimentos biológicos mais recentes com a pesquisa clínica atualizada, na esperança de estabelecer uma diretriz de estadiamento simples, mas precisa, que defina o prognóstico com a maior precisão possível86. A falta de expressão dos receptores de progesterona no câncer de mama tem sido repetidamente relatada nos últimos anos como o fator de mau resultado do tratamento, o que é consistente com os nossos resultados. No trabalho de Purdie e outros, o grupo de pacientes com PR negativo, mesmo os subgrupos que de outra forma teriam um bom prognóstico – ou seja, ER positivo e sem infiltração linfonodal – tinha encurtado significativamente a sobrevida específica do câncer de mama em 5 anos, com ou sem aplicação de quimioterapia87. No trabalho citado, a expressão PR foi o fator prognóstico independente, mais poderoso que o estado de ER. Resultados semelhantes vieram do estudo de van Mackelenbergh et al., onde os cancros mamários ER positivos/PR negativos mostraram melhor resposta inicial ao tratamento, mesmo que eventualmente a sobrevida a longo prazo após quimioterapia neoadjuvante tenha sido significativamente reduzida88. A complexidade do impacto dos estados dos receptores hormonais no resultado do tratamento poderia surgir dos mecanismos de conversa cruzada existentes entre os receptores de estrogênio e progesterona. Quando o PR está ausente, o receptor de estrogênio recruta co-fatores específicos e se liga aos elementos de resposta ao estrogênio na cromatina. O resultado é a ativação de vias que levam à proliferação celular89. Tal cruzamento foi ilustrado no trabalho de Mohammed et al.90, que apontaram que, no câncer de mama, a PR modula o comportamento das ER e sua expressão pode ser vista como um marcador da função das ER.
As análises de fatores genéticos e clínicos podem ser úteis na tentativa de estabelecer os complexos modelos genético-clínicos combinados para a pré-seleção das pacientes em grupos mais uniformes com prognóstico semelhante no que diz respeito à morte, progressão da doença, recorrência, desenvolvimento de câncer de mama metacrônico e resposta global ao tratamento. Para isso, realizamos análises cumulativas e selecionamos os grupos de pacientes com prognóstico aparentemente pior, que carregavam o maior número de fatores desfavoráveis em um determinado cenário. Para cada uma das análises, o componente clínico apontou o avanço da doença. O quadro foi ainda completado com a adição de modificadores genéticos. Devido à frequente falta de dados sobre o impacto exato da variante genética estudada na função gênica ou proteica, toda interpretação do modelo cumulativo deve ser feita com muita cautela. No entanto, o SO e o maior risco de morte foi o resultado óbvio dos estágios avançados de TNM, mas a presença de duas variantes no transportador de doxorubicina SLC22A16 neste modelo enfatiza a importância de um ótimo influxo de drogas para as células. Além disso, a atividade do interruptor principal de desintoxicação NR1/2 no modelo OS parece ser o jogador na mediação do risco de morte. Poderíamos supor que a pior resposta de tratamento a este respeito pode ser o reflexo de vias hiperativas de desintoxicação de qualquer um dos fármacos FAC, que diminuem a concentração terapêutica dos fármacos. Deve-se notar que a força deste modelo é ainda maior pela ausência de incidência de morte no grupo de não portadores de fatores de alto risco.
O grupo com pior prognóstico em relação à progressão do câncer também foi caracterizado pelo avanço da doença (metástases) e variante polimórfica no gene importador de doxorubicina SLC22A16. Neste modelo, no entanto, o quadro foi completado pela presença de dois SNPs no gene receptor da progesterona. O “duplo golpe” como tal, da mesma forma que para o SLC22A16 na análise de SO, aponta as relações entre as vias fisiológicas, metabólicas e de sinalização da progesterona e a capacidade metastática das células cancerosas da mama, bem como o renascimento das micrometástases dormentes. As vias de sinalização da progesterona, vistas como o estado negativo do receptor de PR nas células cancerosas, emergiram também como o componente do pior cenário na análise de sobrevivência sem recorrência. Nesta situação, porém, o alto risco de recorrência foi concomitantemente dependente da modificação no catabolizante 5-fluorouracil DPYD, bem como no AKR1C3, o componente dos mecanismos metabólicos tanto da doxorubicina como da progesterona. Este resultado enfatiza mais uma vez a importância da sinalização da progesterona e da actividade dos mecanismos de desintoxicação, que assegura a concentração óptima das drogas terapêuticas.
Ao nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a avaliar o valor prognóstico do 3′UTR polimorfismo dos genes ADME no contexto da resposta global ao tratamento do cancro da mama. Entretanto, os determinantes clínicos como fatores de alto risco dominaram os fatores genéticos nesta análise. Sem surpresas, os resultados mostraram que o estado negativo do tumor de PR, juntamente com a falta de procedimentos cirúrgicos, que por sua vez é a consequência directa do mau estado da paciente, são os preditores de eventos negativos como morte, progressão, recidiva e o desenvolvimento de outro cancro da mama. O único componente genético neste modelo, variante do ALDH5A1, aponta os mecanismos catabólicos da ciclofosfamida. Além disso, a força deste modelo é apoiada pelos resultados da análise de TFFS. Enquanto a resposta original ao tratamento neste trabalho foi estimada em 10 meses desde o início da quimioterapia, a separação obtida dos pacientes em grupos em relação ao número de fatores desfavoráveis permitiu prever a sobrevida a longo prazo. Após esta análise, relatamos a redução sem precedentes, mais de 14 vezes na mediana de sobrevida entre os grupos com melhor e pior prognóstico.
Em conclusão, as variantes normais da linha germinal comumente presentes na população são fatores importantes que determinam a resposta ao tratamento. O estudo mostra que os polimorfismos são um fator preditor de prognóstico independente da sobrevida da mulher com câncer de mama. Além disso, observamos o efeito do acúmulo de múltiplos fatores genéticos e clínicos desfavoráveis no mau prognóstico de sobrevivência e na resposta global ao tratamento. Os resultados sugerem que os polimorfismos germinativos influenciam a farmacocinética da doxorubicina. Nosso estudo indica as associações mais fortes entre sobrevivência global, sobrevivência sem progressão e polimorfismos genéticos no gene SLC22A16 envolvido no transporte da doxorubicina. Além disso, o SNP no AKR1C3, um gene envolvido no caminho do metabolismo da doxorubicina, tem um efeito na sobrevivência livre de recorrência. Em resumo, a presença de fatores genéticos e clínicos adversos aumenta o risco de mau resultado da resposta ao tratamento em mulheres polacas com câncer de mama que foram tratadas com o regime de FAC. Este estudo implica que a seleção de pacientes com base nos modelos de fatores desfavoráveis cumulativos pode ser útil na previsão do prognóstico em relação à morte, progressão ou recorrência.