In questo studio, abbiamo studiato l’associazione tra gli SNPs 3′UTR dei geni coinvolti nel trasporto dei farmaci FAC, nel metabolismo, nella regolazione delle vie di detossificazione, nei recettori nucleari, nei parametri clinici e nella risposta globale alla chemioterapia FAC. I risultati suggeriscono che il rischio di morte, di progressione della malattia o di recidiva del cancro al seno è modificato dalle varianti genetiche dei recettori nucleari (NR1/2, PGR), dei geni impegnati nella principale via metabolica della doxorubicina (SLC22A16) e del gene legato alla doxorubicina-progesterone (AKR1C3). Gli SNPs all’interno dei geni DPYD e ALDH5A1 erano significativamente associati all’aumento del rischio di RFS e alle analisi della risposta al trattamento/TFFS. I fattori prognostici clinici che hanno influenzato la sopravvivenza e la risposta al trattamento nel nostro studio si sono raggruppati in tre categorie – i componenti della stadiazione TNM in OS e PFS, lo stato del recettore del progesterone del tumore in RFS e risposta/TFFS, e l’attuazione di procedure chirurgiche (indipendentemente dalla loro estensione) nelle analisi di risposta al trattamento/TFFS.

La famiglia di PXR svolge una funzione di regolazione in riferimento agli enzimi della I fase (enzimi del citocromo P450 CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9 e CYP2C19), enzimi della II fase (UGT1A1, UGT1A2, SULT2A) e trasportatori della III fase (ABCB1, OATs, MRP3)37,38,39,40,41,42. 3′UTR del recettore X pregnano (NR1/2/PXR2), un componente chiave del sensore xenobiotico, sono obiettivi per la presenza di diversi microRNA, tra cui miR-362-5p, miR-500b-5p e miR-501-5p, che suggerisce l’importanza della regolazione epigenetica di espressione NR1/221. Le nostre osservazioni delle correlazioni tra la variante genetica 3′UTR del suddetto gene e la sopravvivenza dei pazienti sembrano sostenere tale affermazione, tuttavia l’esatto collegamento genetico-clinico deve ancora essere confermato. Reuter e colleghi hanno cercato tale correlazione, e mentre hanno mostrato un impatto dei polimorfismi NR1/2 sull’espressione della proteina in campioni di sangue e tessuto di pazienti con carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC), non sono stati in grado di dimostrare la loro influenza sui tempi di sopravvivenza globale43.

A prescindere dall’inconsistenza dei risultati della ricerca, è plausibile che le variazioni genetiche all’interno di NR1/2 che influenzano l’espressione o l’attività delle proteine, abbiano effetti clinici significativi di carattere diverso38. SNPs all’interno della sequenza codificante del gene NR1/2 hanno correlato con il rischio di cancro globale44, progressione di AIDS45, erano il potenziale fattore di rischio di resistenza ai farmaci in epilessia46 così come di tossicità ematologica indotta da irinotecan in pazienti con cancro colorettale47. Le varianti genetiche nella regione 3′UTR di NR1/2 influenzano il trasporto, la localizzazione e la stabilità di NR1/2 mRNA14,40. Diversi studi hanno confermato l’influenza degli SNPs 3′UTR di NR1/2 sugli effetti del trattamento con conseguente aumento della resistenza alla chemioterapia anche in pazienti con cancro al seno39,40,41,42. Il gruppo di Oleson ha associato gli rs3732359 e rs3732360 di NR1/2 con una maggiore attività del CYP3A in vivo. Il CYP3A4 è il principale enzima di metabolizzazione dei farmaci e gene effettore a valle di NR1/2. Inoltre, Oleson et al. hanno trovato che le varianti rs3732359 e rs3732360 di NR1/2 mostravano una clearance mediana del midazolam orale più elevata rispetto ai genotipi omozigoti di riferimento per questi SNPs38. Nel nostro gruppo di pazienti, la presenza di rs3732359 AA NR1/2 era un predittore indipendente di OS. Nelle analisi univariate portatori con genotipo AA presentano un aumento di quasi 2 volte nel rischio di morte rispetto ai pazienti NR1/2 rs3732359 AG/GG. Questa osservazione ha suggerito l’associazione di rs3732359 AA NR1/2 con prognosi di sopravvivenza peggiore in donne con cancro al seno trattato con chemioterapia FAC. Osservazioni simili alle nostre sono state riportate nello studio di Swart et al. dove l’allele rs3732359 A NR1/2 ha differenziato i pazienti in sottogruppi secondo la sproporzione dei farmaci e la risposta alla terapia21. Questo risultato era in accordo con le osservazioni di Chew et al. che rs3732359 NR1/2 era associato a una significativa riduzione dell’emoglobina nadir, delle piastrine e/o della conta assoluta dei neutrofili (ANC) dal basale nel ciclo 1, dipendente o indipendente dagli effetti sulla farmacocinetica del docetaxel in pazienti con cancro nasofaringeo48. Questi risultati suggeriscono l’effetto di rs3732359 sulla capacità ematopoietica del midollo osseo, e la capacità di impegnare meccanismi di detossificazione in presenza di xenobiotici.

Nel nostro studio c’era una chiara associazione di polimorfismi all’interno del gene SLC22A16 impegnato nel trasporto di doxorubicina con il rischio di morte e progressione della malattia. Ota et al. e Faraji et al. ha spinto che polimorfismi all’interno SLC22A16 influenzato farmacodinamica sistemica della chemioterapia a base di doxorubicina49,50. Nel nostro studio, portatori rs7756222 CC e rs9487402 TG/GG SLC22A16 hanno diminuito OS. Inoltre, variante rs7756222 CC SLC22A16 era il fattore indipendente accorciando PFS. I nostri risultati sono coerenti con i risultati di Lal et al. 2007, che SNPs in SLC22A16 sono associati con OS più breve e PFS in pazienti asiatici cancro al seno51. Inoltre, studi precedenti hanno confermato l’associazione di SNPs all’interno di SLC22A16 con effetti collaterali tossici in chemioterapia in pazienti con cancro al seno36,50,52. Inoltre, la sovraespressione di SLC22A16 nelle cellule tumorali è associata all’aumento dell’afflusso di doxorubicina nelle cellule e si correla con una maggiore sensibilità agli effetti citotossici di questo farmaco53. Nei pazienti con cancro gastrico, l’upregolazione di SLC22A16 ha indipendentemente predetto una scarsa OS e RFS, nel cancro gastrico precoce e una scarsa OS nel cancro gastrico avanzato54. Kunii et al. hanno anche dimostrato che SLC22A16 è un mediatore dell’assorbimento del platino nelle cellule tumorali, e la down-regolazione di SLC22A16 è probabilmente uno dei meccanismi di resistenza al cisplatino nel cancro del polmone55. I rapporti citati confermano che le varianti genetiche all’interno del gene SLC22A16 influenzano l’efficacia dell’importazione di farmaci chemioterapici nella cellula, mentre la tossicità generata dal livello di farmaco cambiato nella cellula ha corroborato con la peggiore risposta al trattamento.

Siamo presenti due fattori prognostici genetici indipendenti che hanno influenzato significativamente il rischio di PFS ridotta (rs1824125 GG e CC rs11224560 di PGR) e RFS (rs3209896 AG AKR1C3) in pazienti con cancro al seno. A nostra conoscenza, questo è il primo rapporto delle potenziali interazioni di entrambi rs1824125 GG e rs11224560 CC del recettore del progesterone così come rs3209896 AG AKR1C3 (gene legato al progesterone) con la sopravvivenza e la risposta al trattamento. Sfortunatamente, i dati funzionali per gli rs1824125 e rs11224560 del PGR mancano, ma la posizione delle varianti studiate nelle sequenze di regolazione del gene indica il loro sospetto ruolo nel controllo dell’espressione. È comunemente noto che l’espressione controllata del recettore del progesterone è cruciale per lo sviluppo del tessuto mammario, tanto più che il gene PGR ha due promotori e siti di inizio traslazione e produce due isoforme, PR-A e PR-B. Il PR-B è il regolatore positivo degli effetti del progesterone, ma il PR-A antagonizza gli effetti del PR-B56. L’espressione equilibrata di entrambe le isoforme PR è necessaria per mantenere la funzione della ghiandola mammaria, e qualsiasi squilibrio è associato all’aumento del rischio di cancro al seno. A questo proposito, è stato dimostrato che un equilibrio alterato di PR-A e PR-B distorce gli effetti del progesterone sulle cellule mammarie, aumentando così il rischio di cancro al seno57.

In questo studio abbiamo presentato la possibile relazione tra il rischio di recidiva locale e la variante rs3209896 AG in AKR1C3. AKR1C3 è un enzima che metabolizza i farmaci di fase I implicato nella resistenza ai chemioterapici, compresa la doxorubicina58. Gioca un ruolo significativo nella disattivazione della doxorubicina in doxorubicinolo, un metabolita meno attivo59. I polimorfismi in AKR1C3 sono stati studiati come fattori di rischio per il cancro ai polmoni, alla prostata60, al linfoma61 e alla vescica62. Ci sono anche rapporti riguardanti il ruolo della variazione di AKR1C3 nel rischio di progressione della malattia e di mortalità nel linfoma non-Hodgkin a cellule B63, così come nella modulazione della tossicità del trattamento e del tempo di sopravvivenza in pazienti con cancro al seno58. Tuttavia, l’influenza del polimorfismo rs3209896 sul rischio di cancro e sulla risposta alla chemioterapia è stata considerata solo in due studi precedenti, ma senza successo. Nel primo, pazienti asiatici di cancro al seno trattati con chemioterapia contenente doxorubicina non hanno mostrato alcuna correlazione tra rs3209896 AG AKR1C3 con chemiotossicità, PFS e OS58. Nel secondo studio, analisi genetiche materne e prole del gene AKR1C3 non ha rivelato l’associazione di rs3209896 AKR1C3 in relazione al rischio di leucemia infantile61. Nel nostro studio il collegamento genetico-clinico per quanto riguarda l’esito nelle pazienti con cancro al seno trattate con il regime FAC contenente doxorubicina, d’altra parte, esisteva. Uno studio precedente ha suggerito che AKR1C3 appartiene alla famiglia dei geni legati al progesterone coinvolti nel metabolismo prerecettore del progesterone e credeva che fosse un attivatore più debole del PGR64. Dati questi dati, i nostri risultati sottolineano ulteriormente l’importanza clinica delle vie di segnalazione del progesterone. Lo studio di Reding et al. ha dimostrato che la variazione nei geni AKR1C2 e AKR1C3 potrebbe aumentare il rischio di cancro al seno tra le donne che hanno utilizzato la terapia estrogeno-progesterone65. Un ruolo putativo nel cancro al seno basato sugli enzimi AKR1C che metabolizzano il progesterone in un 4-pregnene è stato descritto da Ji et al. Questi autori hanno ipotizzato che la perdita di AKR1C1 e AKR1C2, ma non di AKR1C3 nel cancro al seno, ha portato a una diminuzione del catabolismo del progesterone che, in combinazione con l’aumento dell’espressione di PR, può aumentare la segnalazione del progesterone dai suoi recettori nucleari64.

Nel nostro studio i portatori di rs291593 CC DPYD avevano un rischio maggiore di recidiva. DPYD catabolizza il 5-fluorouracile (5-FU), che è comunemente usato per il trattamento dei carcinomi solidi66,67,68, ed è anche il componente del regime FAC. Una diminuzione dell’attività enzimatica può portare a un aumento dell’emivita del 5-FU e a un aumento del rischio di tossicità dipendente dalla dose67,68,69,70. Lo SNP rs291593 CC DPYD è stato descritto nello studio di Kim et al. che si è concentrato sulla distribuzione allelica in 150 soggetti coreani68. Purtroppo, non ci sono dati in letteratura sull’effetto di rs291593 DPYD e la correlazione con la sopravvivenza e la risposta al trattamento.

Infine, nel nostro gruppo di pazienti analizzati il polimorfismo rs1054899 AG/AA ALDH5A1 correlato con peggiore risposta alla chemioterapia FAC. ALDH5A1 è un componente della via metabolica della ciclofosfamide. La carenza di questo enzima è un raro disordine neurologico autosomico recessivo in cui un grave difetto enzimatico legato alla mutazione genica nella via di degradazione del GABA causa un aumento consecutivo sia del GABA che dell’acido gamma-idrossibutirrico (GHB)71,72,73,74,75. Oltre alle vie neurotrasmettitoriali, l’ALDH5A1, insieme all’ALDH1A1 e 3A1, partecipa alla trasformazione della ciclofosfamide, guidando la detossificazione dell’aldofosfamide in carbossifosfamide inattiva76. È ampiamente accettato che le differenze interindividuali nella formazione dei metaboliti della ciclofosfamide possono derivare da polimorfismi nei geni che catalizzano le reazioni metaboliche, così come da cambiamenti nella loro espressione77. Anche se mancano i dati relativi all’impatto esatto della variazione 3′UTR regolatoria di ALDH5A1 sull’attività della ciclofosfamide, ci sono rapporti che suggeriscono la connessione tra l’espressione dell’enzima e la prognosi del trattamento. Il gruppo di Tian ha riferito che una bassa espressione di ALDH5A1 è un eccellente fattore predittivo di cattiva prognosi nel cancro ovarico (OC) e può svolgere un ruolo cruciale nella progressione del cancro ovarico. L’associazione positiva tra l’espressione di ALDH5A1 e la prognosi è stata trovata nelle fasi iniziali e avanzate delle pazienti con cancro ovarico. Nei gradi II/III del cancro ovarico, un alto livello di mRNA di ALDH5A1 è stato associato a un migliore OS78. Studi condotti su pazienti cinesi affetti da epilessia hanno confermato che rs1054899 del gene ALDH5A1 può avere un ruolo nella farmacocinetica dell’acido valproico (VPA) con proprietà anticonvulsivanti79.

Nelle nostre analisi, la ridotta OS e PFS, e l’alto rischio di morte e progressione, erano il risultato di una malattia avanzata – dimensione del tumore superiore a 20 mm nella dimensione maggiore (cioè componente T maggiore di T1), linfonodi regionali infiltrati (cioè componente N diversa da N0) e la presenza di metastasi a distanza (M1). Queste osservazioni sono in accordo con la percezione tradizionale della progressione graduale dei tumori al seno, da tumori piccoli, non ancora diffusi, a quelli più grandi e aggressivi80. La dimensione del tumore (componente T) è vista come uno dei fattori più cruciali della risposta al trattamento. Nello studio di Goorts et al.81 la dimensione clinica del tumore (cT) era il più forte predittore del raggiungimento della risposta completa patologica (pCR), vista come assenza di cancro residuo, nel gruppo di pazienti con cancro al seno dopo la chemioterapia neoadiuvante. In questo studio, gli stadi cT più alti avevano tassi di pCR molto bassi e significativi, indipendentemente dal grado e dal progesterone, dai recettori estrogeni e dallo stato HER2. Inoltre, la più recente, ottava edizione del Cancer Staging Manual82 conferma che l’intero sistema di stadiazione TNM per il cancro al seno è la stima del volume totale del tumore, descritto dalla dimensione massima della massa tumorale, senza l’inclusione di ulteriori piccoli focolai satellite che circondano il tumore principale83.

La presenza di metastasi linfonodali regionali è un altro fattore riconosciuto di prognosi peggiore nelle pazienti con cancro al seno. Secondo le linee guida più recenti, la classificazione dei linfonodi viene fatta in base alla dimensione del deposito tumorale più grande, e la somma dei linfonodi infiltrati risulta nel valore N finale82. In generale, l’entità del coinvolgimento dei linfonodi si riflette in un peggioramento della prognosi dei pazienti, visto – tra l’altro – in un tempo di sopravvivenza ridotto84. Allo stesso modo, la presenza, la localizzazione e l’estensione delle metastasi a distanza sono inequivocabilmente responsabili della cattiva prognosi, e si stima che il 90% dei decessi legati al cancro al seno sia dovuto alla diffusione metastatica85. Tale drastica correlazione è stata vista anche nelle nostre analisi, dove la presenza di metastasi a distanza è stata il più forte fattore, anche statisticamente, di riduzione della sopravvivenza. Questa situazione sembra riflettere le discordanze tra i tumori primari e secondari, per quanto riguarda le caratteristiche cliniche e biologiche che modificano il tasso di risposta al trattamento tra queste sedi. Inoltre, ci sono modelli complicati che collegano la diffusione metastatica con la localizzazione della massa primaria, l’età dei pazienti e anche con l’impatto imprevisto delle procedure chirurgiche sulla massa tumorale principale, che può favorire la crescita di micrometastasi dormienti in diversi organi85.

Nel nostro studio lo stato negativo del recettore del progesterone per il cancro al seno era il determinante di un alto rischio di recidiva, un TFFS più breve e la mancanza di risposta al trattamento. Lo stato di PR, recettori estrogeni (ER) sono tra i fattori biologici, a parte l’espressione di HER2 e il grado, che sono stati incorporati nel sistema di stadiazione del cancro al seno. L’obiettivo di tale approccio era quello di combinare le ultime conoscenze biologiche con la ricerca clinica aggiornata nella speranza di stabilire una semplice ma accurata linea guida di stadiazione che definisca la prognosi con la maggior precisione possibile86. La mancanza di espressione del recettore del progesterone nel carcinoma mammario è stata negli ultimi anni ripetutamente segnalata come fattore di scarso esito del trattamento, il che è coerente con i nostri risultati. Nel lavoro di Purdie e altri, il gruppo di pazienti PR-negative, anche i sottogruppi che altrimenti avrebbero una buona prognosi – cioè ER-positivi e senza infiltrazione linfonodale – avevano significativamente ridotto la sopravvivenza specifica a 5 anni del cancro al seno, con o senza applicazione della chemioterapia87. Nel lavoro citato, l’espressione PR era il fattore prognostico indipendente, più potente dello stato ER. Risultati simili sono venuti dallo studio di van Mackelenbergh et al., dove i tumori al seno ER-positivi/PR-negativi hanno mostrato una migliore risposta iniziale al trattamento, anche se alla fine la sopravvivenza a lungo termine dopo la chemioterapia neoadiuvante era stata significativamente ridotta88. La complessità dell’impatto dello stato dei recettori ormonali sull’esito del trattamento potrebbe derivare dai meccanismi di cross-talk esistenti tra i recettori degli estrogeni e del progesterone. Quando il PR è assente, il recettore degli estrogeni recluta cofattori specifici e si lega agli elementi di risposta degli estrogeni nella cromatina. Il risultato è l’attivazione di percorsi che portano alla proliferazione cellulare89. Tale diafonia è stata illustrata nel lavoro di Mohammed et al.90, i quali hanno sottolineato che nel cancro al seno PR modula il comportamento di ER, e la sua espressione può essere vista come un marcatore della funzione di ER.

Le analisi dei fattori genetici e clinici potrebbero essere utili nel tentativo di stabilire i complessi modelli combinati genetico-clinici per la preselezione delle pazienti in gruppi più uniformi con prognosi simile per quanto riguarda la morte, la progressione della malattia, la recidiva, lo sviluppo di cancro al seno metacronico e la risposta complessiva al trattamento. Per fare questo, abbiamo eseguito analisi cumulative e selezionato i gruppi di pazienti con la prognosi apparentemente peggiore, che portavano il maggior numero di fattori sfavorevoli in un dato scenario. Per ogni analisi, la componente clinica ha evidenziato l’avanzamento della malattia. Il quadro è stato ulteriormente completato dall’aggiunta di modificatori genetici. A causa della frequente mancanza di dati riguardanti l’esatto impatto della variante genetica studiata sulla funzione del gene o della proteina, ogni interpretazione del modello cumulativo deve essere fatta con grande cautela. Ciononostante, l’OS e il più alto rischio di morte erano il risultato ovvio degli stadi TNM avanzati, ma la presenza di due varianti nel trasportatore di doxorubicina SLC22A16 in questo modello sottolinea l’importanza dell’afflusso ottimale del farmaco alle cellule. Inoltre, l’attività del principale interruttore di detossificazione NR1/2 nel modello OS sembra essere l’attore nella mediazione del rischio di morte. Potremmo supporre che la peggiore risposta al trattamento in questo senso può essere il riflesso di vie di disintossicazione iperattive di uno qualsiasi dei farmaci FAC, che diminuiscono la concentrazione terapeutica dei farmaci. Va notato che la forza di questo modello è ulteriormente rafforzata dalla mancanza di incidenze di morte nel gruppo di non portatori di fattori ad alto rischio.

Il gruppo con la prognosi peggiore per quanto riguarda la progressione del cancro era anche caratterizzato dall’avanzamento della malattia (metastasi) e dalla variante polimorfica nel gene importatore di doxorubicina SLC22A16. Tuttavia, in questo modello il quadro è stato completato dalla presenza di due SNPs nel gene del recettore del progesterone. Il “doppio colpo” in quanto tale, come per l’SLC22A16 nell’analisi OS, indica le relazioni tra le vie fisiologiche, metaboliche e di segnalazione del progesterone e la capacità metastatica delle cellule del cancro al seno, così come la rinascita di micrometastasi dormienti. Le vie di segnalazione del progesterone, viste come lo stato negativo del recettore PR nelle cellule tumorali, sono emerse anche come componente dello scenario peggiore nell’analisi della sopravvivenza libera da recidiva. In questa situazione, tuttavia, l’alto rischio di recidiva era concomitantemente dipendente dalla modifica nel catabolizzatore del 5-fluorouracile DPYD, così come in AKR1C3, il componente dei meccanismi metabolici sia della doxorubicina che del progesterone. Questo risultato sottolinea ancora una volta l’importanza della segnalazione del progesterone e l’attività del macchinario di detossificazione, che assicura la concentrazione ottimale dei farmaci terapeutici.

A nostra conoscenza, questo è il primo studio a valutare il valore prognostico dei polimorfismi 3′UTR dei geni ADME nel contesto della risposta complessiva al trattamento nel cancro al seno. Tuttavia, i determinanti clinici come alti fattori di rischio hanno dominato quelli genetici in questa analisi. Non sorprende che i risultati abbiano mostrato che lo stato negativo del tumore PR, insieme alla mancanza di procedure chirurgiche, che a sua volta è la conseguenza diretta delle cattive condizioni della paziente, sono i predittori di eventi negativi come la morte, la progressione, la recidiva e lo sviluppo di un altro cancro al seno. L’unica componente genetica in questo modello, variante in ALDH5A1, indica i meccanismi catabolici della ciclofosfamide. Inoltre, la forza di questo modello è sostenuta dai risultati dell’analisi TFFS. Mentre la risposta al trattamento originale in questo lavoro è stata stimata entro 10 mesi dall’inizio della chemioterapia, la separazione ottenuta dei pazienti in gruppi in relazione al numero di fattori sfavorevoli ha permesso di prevedere la sopravvivenza a lungo termine. In seguito a questa analisi riportiamo la riduzione senza precedenti, oltre 14 volte, della sopravvivenza mediana tra i gruppi con la prognosi migliore e peggiore.

In conclusione, le varianti germinali normali comunemente presenti nella popolazione sono fattori importanti che determinano la risposta al trattamento. Lo studio dimostra che i polimorfismi sono un fattore predittivo prognostico indipendente della sopravvivenza nella donna con cancro al seno. Inoltre, abbiamo osservato l’effetto dell’accumulo di più fattori genetici e clinici sfavorevoli sulla cattiva prognosi di sopravvivenza e sulla risposta complessiva al trattamento. I risultati suggeriscono che i polimorfismi germinali influenzano la farmacocinetica della doxorubicina. Il nostro studio indica le associazioni più forti tra la sopravvivenza globale, la sopravvivenza libera da progressione e i polimorfismi genetici nel gene SLC22A16 impegnato nel trasporto della doxorubicina. Inoltre, SNP nel gene AKR1C3, un gene coinvolto nella via del metabolismo della doxorubicina, ha un effetto sulla sopravvivenza libera da recidiva. Per riassumere, la presenza di fattori genetici e clinici avversi aumenta il rischio di un cattivo esito della risposta al trattamento nelle donne polacche con cancro al seno che sono state trattate con il regime FAC. Questo studio implica che la selezione dei pazienti basata sui modelli cumulativi di fattori sfavorevoli può essere utile per prevedere la prognosi per quanto riguarda la morte, la progressione o la recidiva.