I denne undersøgelse, undersøgte vi forbindelsen mellem 3′UTR SNP’er af gener, der er involveret i FAC-lægemidlers transport, metabolisme, regulering af afgiftningsveje, nukleare receptorer, kliniske parametre og det samlede respons på FAC-kemoterapi. Resultaterne tyder på, at risikoen for død, sygdomsprogression eller tilbagefald af brystkræft ændres af genetiske varianter af nukleare receptorer (NR1/2, PGR), gener, der er involveret i doxorubicins vigtigste metaboliske vej (SLC22A16) og doxorubicin-progesteron-relateret gen (AKR1C3). SNP’er inden for DPYD- og ALDH5A1-generne var signifikant forbundet med den øgede risiko for RFS og analyser af behandlingsrespons/TFFS. De kliniske prognostiske faktorer, der påvirkede overlevelse og behandlingsrespons i vores undersøgelse, har grupperet sig i tre kategorier – komponenterne i TNM-stadiering i OS og PFS, tumorprogesteronreceptorstatus i RFS og respons/TFFS og gennemførelsen af kirurgiske procedurer (uanset deres omfang) i analyser af behandlingsrespons/TFFS.

PXR-familien spiller en regulerende funktion i forhold til enzymer i fase I (cytokrom P450-enzymer CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9 og CYP2C19), enzymer i fase II (UGT1A1, UGT1A2, SULT2A) og fase III-transportører (ABCB1, OATs, MRP3)37,38,39,39,40,41,42. 3′UTR af pregnan X-receptoren (NR1/2/PXR2), en nøglekomponent i xenobiotika-sensoren, er mål for tilstedeværelsen af flere mikroRNA’er, herunder miR-362-5p, miR-500b-5p og miR-501-5p, hvilket tyder på betydningen af epigenetisk regulering af NR1/2-ekspression21. Vores observationer af sammenhængen mellem den nævnte genets 3′UTR genetiske variant og patienternes overlevelse synes at understøtte denne påstand, men den nøjagtige genetisk-kliniske sammenhæng er endnu ikke blevet bekræftet. Reuter og kolleger søgte efter en sådan sammenhæng, og selv om de påviste en indvirkning af NR1/2-polymorfismer på proteinekspression i blod- og vævsprøver af patienter med pladecellekarcinom i hoved og hals (HNSCC), kunne de ikke påvise deres indflydelse på den samlede overlevelsestid43.

Uanset af inkonsekvensen i forskningsresultaterne er det plausibelt, at genetiske variationer inden for NR1/2, der påvirker proteinekspression eller -aktivitet, har betydelige kliniske virkninger af forskellig karakter38. SNP’er inden for NR1/2-genets kodningssekvens har korreleret med risikoen for generel kræft44 , progression af AIDS45 , var den potentielle risikofaktor for lægemiddelresistens i epilepsi46 samt for hæmatologisk toksicitet induceret af irinotecan hos patienter med colorectal cancer47. Genetiske varianter i NR1/2’s 3′UTR-region påvirker transport, lokalisering og stabilitet af NR1/2 mRNA14,40. Flere undersøgelser har bekræftet, at NR1/2’s 3′UTR SNP’er har indflydelse på behandlingseffekterne med en deraf følgende øget resistens over for kemoterapi, også hos brystkræftpatienter39,40,41,42. Gruppen af Oleson forbandt rs3732359 og rs3732360 af NR1/2 med højere CYP3A-aktivitet in vivo. CYP3A4 er det vigtigste lægemiddelmetaboliserende enzym og downstream effektor-gen for NR1/2. Endvidere fandt Oleson et al., at varianter rs3732359 og rs3732360 af NR1/2 udviste højere median oral midazolam clearance sammenlignet med homozygote referencegenotyper for disse SNP’er38. I vores gruppe af patienter var tilstedeværelsen af rs3732359 AA NR1/2 en uafhængig prædiktor for OS. I univariate analyser præsenterer bærere med genotype AA en næsten 2-dobbelt stigning i risikoen for død sammenlignet med patienter NR1/2 rs3732359 AG/GG. Denne observation tyder på, at rs3732359 AA NR1/2 er forbundet med en dårligere overlevelsesprognose hos kvinder med brystkræft, der behandles med FAC-kemoterapi. Observationer, der ligner vores, blev rapporteret i undersøgelsen af Swart et al., hvor rs3732359 allel A NR1/2 differentierede patienterne i undergrupper i henhold til lægemiddeldisproportion og terapisvar21. Dette resultat var i overensstemmelse med Chew et al.s observationer, at rs3732359 NR1/2 var forbundet med en signifikant reduktion i nadirhæmoglobin, trombocytter og/eller absolut neutrofiltal (ANC) fra baseline i cyklus 1, enten afhængig eller uafhængig af virkningerne på farmakokinetikken af docetaxel hos patienter med nasopharyngeal cancer48. Disse resultater tyder på effekten af rs3732359 på knoglemarvens hæmatopoietiske kapacitet og evnen til at aktivere afgiftningsmekanismer i tilstedeværelse af xenobiotika.

I vores undersøgelse var der en klar sammenhæng mellem polymorfismer inden for SLC22A16-genet, der er involveret i doxorubicintransport, og risikoen for død og sygdomsprogression. Ota et al. og Faraji et al. skubbede, at polymorfismer inden for SLC22A16 påvirkede den systemiske farmakodynamik af doxorubicinbaseret kemoterapi49,50. I vores undersøgelse har bærere af rs7756222 CC og rs9487402 TG/GG SLC22A16 nedsat OS. Desuden var variant rs7756222 CC SLC22A16 den uafhængige faktor, der forkorter PFS. Vores resultater er i overensstemmelse med resultaterne fra Lal et al. 2007, at SNP’er i SLC22A16 er forbundet med kortere OS og PFS hos asiatiske brystkræftpatienter51. Desuden har tidligere undersøgelser bekræftet, at SNP’er inden for SLC22A16 er forbundet med toksiske bivirkninger ved kemoterapi hos brystkræftpatienter36,50,52. Desuden er overekspression af SLC22A16 i kræftceller forbundet med den stigende tilstrømning af doxorubicin til cellen og korrelerer med øget følsomhed over for de cytotoksiske virkninger af dette lægemiddel53. Hos patienter med gastrisk cancer forudsagde SLC22A16-opregulering uafhængigt dårlig OS og RFS i tidlig gastrisk cancer og dårlig OS i fremskreden gastrisk cancer54. Kunii et al. viste også, at SLC22A16 er en mediator for platinoptagelse i kræftceller, og nedregulering af SLC22A16 er muligvis en af mekanismerne for resistens over for cisplatin i lungekræft55. De citerede rapporter bekræfter, at de genetiske varianter inden for SLC22A16-genet påvirker kemoterapeutiske lægemidlers importvirkning i cellen, mens toksicitet genereret af det ændrede lægemiddelniveau i cellen korrogerede med det dårligste behandlingsrespons.

Vi præsenterer to uafhængige genetiske prognostiske faktorer, der signifikant påvirkede risikoen for forkortet PFS (rs1824125 GG og CC rs11224560 af PGR) og RFS (rs3209896 AG AKR1C3) hos brystkræftpatienter. Så vidt vi ved, er dette den første rapport om de potentielle interaktioner af både rs1824125 GG og rs11224560 CC progesteronreceptor samt rs3209896 AG AKR1C3 (progesteronrelateret gen) med overlevelsen og behandlingsresponset. Desværre mangler de funktionelle data for PGR’s rs1824125 og rs11224560, men de undersøgte varianters placering i genreguleringssekvenserne peger på deres formodede rolle i ekspressionskontrollen. Det er almindeligt kendt, at den kontrollerede ekspression af progesteronreceptoren er afgørende for brystvævets udvikling, så meget desto mere, at PGR-genet har to promotorer og translationelle startsteder og producerer to isoformer, PR-A og PR-B. PR-B er den positive regulator af progesteronets virkninger, men PR-A modvirker virkningerne af PR-B56. Balanceret ekspression af begge PR-isoformer er nødvendig for at opretholde brystkirtelfunktionen, og enhver ubalance er forbundet med en øget risiko for brystkræft. I denne henseende blev det vist, at en ændret PR-A- og PR-B-balance forvrænger progesteronets virkninger på brystceller og dermed øger risikoen for brystkræft57.

I denne undersøgelse præsenterede vi den mulige sammenhæng mellem risikoen for lokalrecidiv og rs3209896 AG-varianten i AKR1C3. AKR1C3 er et fase I lægemiddelmetaboliserende enzym, der er involveret i lægemiddelresistens over for kemoterapeutika, herunder doxorubicin58. Det spiller en væsentlig rolle i deaktiveringen af doxorubicin til doxorubicinol, en mindre aktiv metabolit59. Polymorfismer i AKR1C3 blev undersøgt som risikofaktorer for lungekræft, prostatakræft60 , lymfekræft61 og blærekræft62. Der er også rapporter om den rolle, som AKR1C3-variationen spiller for risikoen for sygdomsprogression og dødelighed i B-celle non-Hodgkin lymfom63 samt for modulation af behandlingstoksicitet og overlevelsestid hos brystkræftpatienter58. Imidlertid blev indflydelsen af rs3209896-polymorfismen på kræftrisiko og kemoterapirespons kun overvejet i to tidligere undersøgelser, men uden held. I den første har asiatiske brystkræftpatienter, der blev behandlet med doxorubicinholdig kemoterapi, ikke vist nogen korrelation mellem rs3209896 AG AKR1C3 med kemotoksicitet, PFS og OS58. I den anden undersøgelse afslørede moderens og afkommets genetiske analyser af AKR1C3-genet ingen association af rs3209896 AKR1C3 i forhold til leukæmirisiko i barndommen61. I vores undersøgelse fandtes der til gengæld en genetisk-klinisk sammenhæng med hensyn til resultatet hos brystkræftpatienter, der blev behandlet med doxorubicinholdige FAC-regimer. Tidligere undersøgelse foreslog, at AKR1C3 tilhører familien af progesteronrelaterede gener, der er involveret i prereceptormetabolismen af progesteron, og mente, at det var en svagere aktivator af PGR64. I betragtning af disse data understreger vores resultater yderligere den kliniske betydning af progesteron-signalveje. Undersøgelse af Reding et al. viste, at variationen i AKR1C2- og AKR1C3-generne kunne øge risikoen for brystkræft blandt kvinder, der har brugt østrogen-progesteronbehandling65. En formodet rolle i brystkræft baseret på AKR1C-enzymerne, der metaboliserer progesteron til et 4-pregnen, blev beskrevet af Ji et al. Disse forfattere spekulerede i, at tab af AKR1C1 og AKR1C2, men ikke AKR1C3 i brystkræft, resulterede i nedsat progesteron-katabolisme, hvilket i kombination med øget PR-ekspression kan øge progesteronsignalering via dets nukleare receptorer64.

I vores undersøgelse havde bærere af rs291593 CC DPYD højere risiko for sygdomsrecidiv. DPYD kataboliserer 5-fluorouracil (5-FU), som almindeligvis anvendes til behandling af solide karcinomer66,67,68, og er også en komponent i FAC-regimet. Et fald i enzymaktiviteten kan føre til en forøgelse af 5-FU’s halveringstid og en øget risiko for dosisafhængig toksicitet67,68,69,70. SNP’en rs291593 CC DPYD blev beskrevet i Kim et al.s undersøgelse, som fokuserede på allelfordelingen hos 150 koreanske forsøgspersoner68. Desværre findes der ingen litteraturdata om effekten af rs291593 DPYD og korrelation med overlevelse og behandlingsrespons.

Sidst i vores analyserede patientgruppe korrelerede polymorfismen rs1054899 AG/AA ALDH5A1 med dårligere respons på FAC-kemoterapien. ALDH5A1 er en komponent i cyclophosphamidmetabolismevejen. En mangel på dette enzym er en sjælden autosomal recessiv neurologisk lidelse, hvor en alvorlig genmutationsrelateret enzymdefekt i GABA-nedbrydningsvejen forårsager en konsekutiv forhøjelse af både GABA og gamma-hydroxibørronsyre (GHB)71,72,73,74,75. Ud over de neurotransmittoriske veje deltager ALDH5A1 sammen med ALDH1A1 og 3A1 i omdannelsen af cyclophosphamid og styrer afgiftningen af aldophosphamid til inaktivt carboxyphosphamid76. Det er almindeligt accepteret, at interindividuelle forskelle i dannelsen af cyclophosphamidmetabolitter kan skyldes polymorfismer i gener, der katalyserer metaboliske reaktioner, såvel som ændringer i deres ekspression77. Selv om der mangler data om den nøjagtige virkning af ALDH5A1’s regulatoriske 3′UTR-variation på cyklofosfamidaktiviteten, er der rapporter, der tyder på en sammenhæng mellem enzymudtryk og behandlingsprognose. Gruppen Tian rapporterede, at lav ALDH5A1-ekspression er en fremragende prædiktiv faktor for dårlig prognose i ovariecancer (OC) og kan spille en afgørende rolle i udviklingen af ovariecancer. Den positive sammenhæng mellem ekspression af ALDH5A1 og prognose blev fundet i tidlige og avancerede stadier af patienter med ovariecancer. I graderne II/III af ovariecancer var et højt mRNA-niveau af ALDH5A1 forbundet med forbedret OS78. Undersøgelser udført på kinesiske epilepsipatienter bekræftede, at rs1054899 i ALDH5A1-genet kan spille en rolle i farmakokinetikken af valproinsyre (VPA) med antikonvulsive egenskaber79.

I vores analyser var den forkortede OS og PFS og den høje risiko for død og progression resultatet af fremskreden sygdom – tumorstørrelse på over 20 mm i største dimension (dvs. T-komponent større end T1), infiltrerede regionale lymfeknuder (dvs. N-komponent forskellig fra N0) og tilstedeværelsen af fjernmetastaser (M1). Disse observationer er i overensstemmelse med den traditionelle opfattelse af den trinvise udvikling af brystkræft fra små, endnu ikke spredte tumorer til større, mere aggressive tumorer80. Tumorstørrelsen (T-komponenten) anses for at være en af de mest afgørende faktorer for respons på behandling. I undersøgelsen af Goorts et al.81 var den kliniske tumorstørrelse (cT) den stærkeste prædiktor for opnåelse af patologisk komplet respons (pCR), der ses som fravær af resterende kræft, i gruppen af brystkræftpatienter efter neoadjuverende kemoterapi. I denne undersøgelse havde højere cT-stadier stærke, signifikant lavere pCR-rater, uafhængigt af grad og progesteron-, østrogenreceptorer og HER2-status. Den nyeste, ottende udgave af Cancer Staging Manual82 bekræfter også, at hele TNM-stadiesystemet for brystkræft er et skøn over det samlede tumorvolumen, der beskrives ved den maksimale dimension af tumormassen, uden inddragelse af yderligere små satellitfoci omkring hovedtumoren83.

Anstedeværelsen af regionale lymfeknudemetastaser er en anden anerkendt faktor for en dårligere prognose hos brystkræftpatienter. I henhold til de nyeste retningslinjer foretages klassificeringen af lymfeknuder ud fra størrelsen af den største tumorudposning, og summen af infiltrerede lymfeknuder resulterer i den endelige N-værdi82. Generelt afspejler omfanget af knudeinvolvering sig i en forværret prognose for patienterne, hvilket bl.a. ses – blandt andet – i en kortere overlevelsestid84. På samme måde er tilstedeværelsen, placeringen og omfanget af fjernmetastaser utvetydigt ansvarlig for dårlig prognose, idet anslået 90 % af brystkræftrelaterede dødsfald skyldes metastatisk spredning85. En sådan drastisk korrelation blev også set i vores analyser, hvor tilstedeværelsen af fjernmetastaser var den stærkeste, også statistisk set, overlevelsesreducerende faktor. Denne situation synes at afspejle uoverensstemmelserne mellem de primære og sekundære tumorer med hensyn til de kliniske og biologiske træk, der ændrer behandlingsresponsraten mellem disse steder. Der er også komplicerede mønstre, der forbinder den metastatiske spredning med placeringen af den primære masse, patienternes alder og også med den uforudsete indvirkning af kirurgiske indgreb på hovedtumormassen, hvilket kan øge væksten af hvilende mikrometastaser i forskellige organer85.

I vores undersøgelse var den negative status for progesteronreceptor i brystkræft afgørende for høj risiko for recidiv, kortere TFFS og manglende respons på behandling. Status for PR, østrogenreceptorer (ER) er blandt de biologiske faktorer, bortset fra HER2-ekspression og grad, som var blevet indarbejdet i brystkræftstadiesystemet. Målet med en sådan fremgangsmåde var at kombinere den nyeste biologiske viden med den nyeste kliniske forskning i håb om at etablere en enkel, men nøjagtig retningslinje for stadieinddeling, der definerer prognosen med den størst mulige præcision86. Manglende progesteronreceptorekspression i brystkræft er i de seneste år blevet rapporteret gentagne gange som en faktor for dårlige behandlingsresultater, hvilket stemmer overens med vores resultater. I Purdie m.fl.’s arbejde havde gruppen af PR-negative patienter, selv de undergrupper, der ellers ville have en god prognose – dvs. ER-positive og uden lymfeknudeinfiltration – en signifikant forkortet 5-års specifik overlevelse for brystkræft, med eller uden anvendelse af kemoterapi87. I det citerede arbejde var PR-ekspressionen den uafhængige prognostiske faktor, der var stærkere end ER-status. Lignende resultater fremkom i en undersøgelse af van Mackelenbergh et al. hvor ER-positive/PR-negative brystkræftformer viste bedre indledende respons på behandling, selv om den langsigtede overlevelse efter neoadjuverende kemoterapi i sidste ende var blevet væsentligt forkortet88. Den komplekse indvirkning af hormonreceptorstatusen på behandlingsresultatet kan skyldes de mekanismer, der findes mellem østrogen- og progesteronreceptorer. Når PR er fraværende, rekrutterer østrogenreceptoren specifikke cofaktorer og binder sig til østrogenresponselementer i kromatin. Resultatet er aktivering af veje, der fører til celleproliferation89. En sådan crosstalk blev illustreret i arbejdet af Mohammed et al.90, som påpegede, at PR i brystkræft modulerer ER-adfærd, og at dets ekspression kan ses som en markør for ER-funktionen.

Analyserne af genetiske og kliniske faktorer kunne være nyttige i forsøget på at etablere de komplekse kombinerede genetisk-kliniske modeller for patienternes forhåndsudvælgelse i mere ensartede grupper med lignende prognose med hensyn til død, sygdomsprogression, recidiv, udvikling af metakronisk brystkræft og samlet behandlingsrespons. Med henblik herpå udførte vi kumulative analyser og udvalgte de grupper af patienter med den tilsyneladende dårligste prognose, som bar på det højeste antal ugunstige faktorer i en given sammenhæng. For hver af analyserne pegede den kliniske komponent på sygdommens fremadskriden. Billedet blev yderligere suppleret ved tilføjelse af genetiske modifikatorer. På grund af den hyppige mangel på data vedrørende den nøjagtige virkning af den undersøgte genetiske variant på gen- eller proteinfunktion skal enhver fortolkning af kumulative modeller foretages med stor forsigtighed. Ikke desto mindre var OS og den højeste risiko for død det indlysende resultat af avancerede TNM-stadier, men tilstedeværelsen af to varianter i doxorubicin-transporter SLC22A16 i denne model understreger betydningen af optimal lægemiddeltilførsel til cellerne. Desuden synes aktiviteten af den vigtigste detoxificeringskontakt NR1/2 i OS-modellen at være den aktør, der formidler dødsrisikoen. Vi kan antage, at det dårligere behandlingsrespons i denne henseende kan være en afspejling af overaktive afgiftningsveje for et af FAC-lægemidlerne, hvilket mindsker lægemidlernes terapeutiske koncentration. Det skal bemærkes, at styrken af denne model forstærkes yderligere af den manglende forekomst af dødsfald i gruppen af ikke-bærere af højrisikofaktorer.

Gruppen med den dårligste prognose med hensyn til kræftfremskridt var også karakteriseret ved sygdomsfremskridt (metastaser) og polymorf variant i doxorubicin importørgen SLC22A16. I denne model blev billedet imidlertid fuldendt af tilstedeværelsen af to SNP’er i progesteronreceptor-genet. Det “dobbelte hit” som sådan, på samme måde som for SLC22A16 i OS-analysen, peger på sammenhængen mellem fysiologiske, metaboliske og signalveje for progesteron og brystkræftcellers metastatiske evne samt genoplivning af hvilende mikrometastaser. Progesteron-signalvejene, der ses som den negative PR-receptorstatus i kræftceller, viste sig også som komponent i det værst tænkelige scenarie i analysen af den recidivfri overlevelse. I denne situation var den høje risiko for recidiv imidlertid samtidig afhængig af ændringen i 5-fluorouracil katabolisator DPYD samt i AKR1C3, der er en komponent i både doxorubicin- og progesteronmetabolisme-mekanismerne. Dette resultat understreger endnu en gang betydningen af progesteron-signalering og aktiviteten af afgiftningsmaskineriet, der sikrer den optimale terapeutiske lægemiddelkoncentration.

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der evaluerer den prognostiske værdi af 3′UTR-polymorfismer af ADME-gener i forbindelse med det samlede behandlingsrespons ved brystkræft. De kliniske determinanter som høje risikofaktorer dominerede dog de genetiske i denne analyse. Resultaterne viste ikke overraskende, at PR-tumornegativ status sammen med manglende kirurgiske indgreb, som igen er en direkte konsekvens af patientens dårlige tilstand, er prædiktorer for negative begivenheder som død, progression, tilbagefald og udvikling af en anden brystkræft. Den eneste genetiske komponent i denne model, en variant i ALDH5A1, peger på de kataboliske mekanismer for cyklofosfamid. Derudover understøttes styrken af denne model af resultaterne af TFFS-analysen. Mens det oprindelige behandlingsrespons i dette arbejde blev estimeret inden for 10 måneder siden kemoterapiens begyndelse, gjorde den opnåede opdeling af patienterne i grupper med hensyn til antallet af ugunstige faktorer det muligt at forudsige langtidsoverlevelsen. Efter denne analyse rapporterer vi den hidtil usete, over 14-dobbelte reduktion i medianoverlevelsen mellem grupperne med den bedste og den dårligste prognose.

Sammenfattende er de normale germlinevarianter, der almindeligvis findes i befolkningen, vigtige faktorer, der bestemmer responset på behandling. Undersøgelsen viser, at polymorfismer er en uafhængig prognostisk forudsigelsesfaktor for overlevelse hos kvinder med brystkræft. Desuden observerede vi effekten af akkumulationen af flere ugunstige genetiske og kliniske faktorer på dårlig overlevelsesprognose og samlet behandlingsrespons. Resultaterne tyder på, at germline polymorfismer påvirker farmakokinetikken af doxorubicin. Vores undersøgelse viser de stærkeste forbindelser mellem den samlede overlevelse, progressionsfri overlevelse og genetiske polymorfismer i SLC22A16-genet, der er involveret i doxorubicintransport. Desuden har SNP i AKR1C3, et gen, der er involveret i doxorubicinmetabolismevejen, en effekt på den recidivfri overlevelse. Sammenfattende kan man sige, at tilstedeværelsen af negative genetiske og kliniske faktorer øger risikoen for dårligt resultat af behandlingsrespons hos polske kvinder med brystkræft, der blev behandlet med FAC-regime. Denne undersøgelse antyder, at udvælgelse af patienter baseret på de kumulative ugunstige faktorer modeller kan være nyttige til at forudsige prognosen med hensyn til død, progression eller recurrency.