本研究では、乳がん患者の生存予測と臨床反応に大きく寄与する遺伝的3UTRバリエーションと臨床的因子を検討した。 我々は、FAC薬の輸送、代謝、解毒経路の調節、核内受容体に関与する遺伝子の3′UTR SNPsと臨床パラメータおよびFAC化学療法に対する全反応との関連性を調査した。 その結果、乳癌の死亡、病勢進行、再発のリスクは、核内受容体（NR1/2、PGR）、ドキソルビシンの主要代謝経路に関わる遺伝子（SLC22A16）、ドキソルビシン・プロゲステロン関連遺伝子（AKR1C3）の遺伝子変異により修飾されていることが示唆された。 DPYD遺伝子とALDH5A1遺伝子のSNPsは、RFSおよび治療効果/TFFS解析のリスク上昇と有意に関連していた。 OSとPFSにおけるTNMステージングの構成要素、RFSとResponse/TFFSにおける腫瘍のプロゲステロン受容体状態、そしてResponse/TFFS解析における手術の実施（その程度に関わらず）である。

PXRのファミリーは、I相の酵素（チトクロームP450酵素CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19）、II相酵素（UGT1A1、UGT1A2、SULT2A）、III相トランスポーター（ABCB1、OATs、MRP3）37，38，39，40，41，42に関して調節機能を担っている。 異種物質センサーの重要な構成要素であるプレグナン X 受容体 (NR1/2/PXR2) の 3′UTR は、miR-362-5p, miR-500b-5p, miR-501-5p など複数の microRNA の存在する標的であり、NR1/2の発現におけるエピジェネティック制御の重要性を示唆している21. この遺伝子の3′UTR遺伝子変異と患者の生存率との間の相関は、そのような声明を支持するように思われるが、正確な遺伝と臨床の関連はまだ確認されていない。 Reuterらは、そのような相関を探し、頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）患者の血液及び組織サンプルにおけるタンパク質発現に対するNR1/2多型の影響を示したが、全生存時間に対する影響を示すことはできなかった43。 NR1/2遺伝子のコード配列内のSNPは、がん全体のリスク44、AIDSの進行45と相関し、てんかんの薬剤耐性46、大腸がん患者のイリノテカンによる血液毒性47の危険因子となりうるものであることが分かっている。 NR1/2 の 3′UTR 領域の遺伝子変異は、NR1/2 mRNA の輸送、局在、安定性に影響を与える14,40。 乳がん患者においても、NR1/2の3′UTR SNPsが治療効果に影響を与え、結果として化学療法に対する抵抗性を増加させることがいくつかの研究で確認されている39,40,41,42。 Olesonのグループは、NR1/2のrs3732359とrs3732360がin vivoで高いCYP3A活性と関連していることを明らかにした。 CYP3A4 は主要な薬物代謝酵素であり、NR1/2 の下流エフェクター遺伝子である。 さらに、Olesonらは、NR1/2の変異体rs3732359およびrs3732360は、これらのSNPsのホモ接合体参照遺伝子型と比較して、経口ミダゾラムクリアランスの中央値が高いことを見出した38。 我々の患者群では、rs3732359 AA NR1/2の存在は、OSの独立した予測因子であった。 単変量解析では、遺伝子型がAAのキャリアは、NR1/2 rs3732359 AG/GGの患者と比較して死亡リスクがほぼ2倍増加した。 この結果は、FAC化学療法を受けた女性乳癌患者の生存予後の悪化とrs3732359 AA NR1/2の関連を示唆するものであった。 Swartらの研究では、rs3732359対立遺伝子A NR1/2が、薬剤の不均衡と治療効果によって患者をサブグループに分化させたという、我々と同様の観察結果が報告されている21。 この結果は、上咽頭癌患者におけるドセタキセルの薬物動態への影響に依存または依存せずに、rs3732359 NR1/2 がベースラインからの1サイクル目の直前のヘモグロビン、血小板、絶対好中球数（ANC）の著しい減少と関連するというChewらの観察結果と一致した48。 これらの結果は、rs3732359が骨髄造血能に影響を与え、有害物質の存在下で解毒機構を働かせる能力を持つことを示唆している。

我々の研究では、ドキソルビシン輸送に関わるSLC22A16遺伝子内の多型と死亡や疾患進行のリスクには明確な関連があった。 太田らやFarajiらは、SLC22A16内の多型がドキソルビシンを用いた化学療法の全身薬理学に影響を与えることを示した49,50。 本研究では、SLC22A16のrs7756222 CCとrs9487402 TG/GGのキャリアはOSを減少させた。 さらに、バリアント rs7756222 CC SLC22A16 は、PFS を短縮する独立した因子であった。 今回の結果は、アジア人乳がん患者においてSLC22A16のSNPがOSおよびPFSの短縮と関連するというLalら（2007）の結果と一致する51。 さらに、先行研究では、乳がん患者の化学療法における毒性副作用とSLC22A16内のSNPsの関連が確認されている36,50,52。 さらに、がん細胞におけるSLC22A16の過剰発現は、細胞内へのドキソルビシンの流入の増加と関連し、この薬剤の細胞毒性作用に対する感受性の増加と相関しています53。 胃がん患者において、SLC22A16の発現増加は、早期胃がんにおけるOSおよびRFSの不良、ならびに進行胃がんにおけるOSの不良を独立に予測した54。 Kuniiらは、SLC22A16が癌細胞における白金取り込みのメディエーターであることも示し、SLC22A16のダウンレギュレーションは、肺癌におけるシスプラチンに対する耐性メカニズムの1つである可能性を示している55。 SLC22A16遺伝子の遺伝子変異が化学療法剤の細胞内への取り込み効果に影響を与え、細胞内の薬剤濃度の変化によって生じる毒性が最悪の治療反応と相関していることが引用された報告から確認された。 プロゲステロン受容体のrs1824125 GGとrs11224560 CCとプロゲステロン関連遺伝子のrs3209896 AG AKR1C3の両方が生存率と治療反応と相互作用する可能性について、我々の知る限り、これは最初の報告である。 残念ながら、PGRのrs1824125とrs11224560の機能データは不足しているが、研究対象となった変異体が遺伝子調節配列に位置することから、発現制御における役割が疑われている。 プロゲステロン受容体の発現制御が乳房組織の発達に重要であることは一般に知られているが、PGR遺伝子には2つのプロモーターと翻訳開始点があり、PR-AとPR-Bという2つのアイソフォームを産生することが分かっている。 PR-Bはプロゲステロンの作用を正に制御するが、PR-AはPR-Bの作用に拮抗する56。 乳腺の機能を維持するためには、両方のPRアイソフォームのバランスのとれた発現が必要であり、バランスが崩れると乳がんのリスクが高まると言われています。 この点で、PR-AとPR-Bのバランスの変化が乳房細胞に対するプロゲステロンの作用を歪め、乳がんリスクを高めることが示された57。

本研究では、局所再発リスクとAKR1C3のrs3209896 AG変異の関係の可能性について発表した。 AKR1C3はドキソルビシンを含む化学療法剤に対する薬剤耐性に関与する第一相の薬剤代謝酵素である58。 AKR1C3は、ドキソルビシンから低活性代謝物であるドキソルビシノールへの脱活性化に重要な役割を担っている59。 AKR1C3 の多型は、肺がん、前立腺がん60、リンパ腫61、膀胱がんの危険因子として研究されている62。 また、B細胞非ホジキンリンパ腫における病勢進行や死亡のリスクにおけるAKR1C3の変異の役割63や、乳がん患者における治療毒性や生存時間の調節に関する報告58がある。 しかし、rs3209896多型のがんリスクと化学療法への影響については、過去2件の研究でのみ検討されたが、成果はなかった。 1つ目は、ドキソルビシンを含む化学療法を受けたアジア人乳がん患者で、rs3209896 AG AKR1C3と化学毒性、PFSおよびOSとの相関は示されなかった58。 2番目の研究では、AKR1C3遺伝子の母子遺伝学的解析により、小児白血病リスクとrs3209896 AKR1C3との関連は明らかにされなかった61。 一方、我々の研究では、ドキソルビシンを含むFAC療法を受けた乳癌患者の転帰に関する遺伝的-臨床的連関は存在した。 AKR1C3はプロゲステロンの前駆体代謝に関与するプロゲステロン関連遺伝子ファミリーに属することが以前の研究で示唆されており、PGR64の弱い活性化因子であると考えられていた。 これらのデータから、我々の結果は、プロゲステロンのシグナル伝達経路の臨床的重要性をさらに強調するものである。 Redingらの研究によると、AKR1C2およびAKR1C3遺伝子の変異は、エストロゲン・プロゲステロン療法を行った女性の乳癌リスクを高める可能性があることが示されている65。 AKR1C 酵素がプロゲステロンを 4-プレグネンに代謝することに基づく乳癌における推定上の役割については、Ji らにより報告された。 乳癌ではAKR1C3ではなくAKR1C1とAKR1C2の欠損により、プロゲステロンの異化作用が低下し、PR発現の増加と相まって核内受容体によるプロゲステロンのシグナル伝達を増強していると推測された64。 DPYDは固形がんの治療によく使われる5-フルオロウラシル（5-FU）を異化する66,67,68、またFACレジームの構成要素でもある。 酵素活性の低下は、5-FUの半減期を増加させ、用量依存的な毒性のリスクを増加させる可能性がある67,68,69,70。 SNP rs291593 CC DPYDは、韓国の150人の被験者における対立遺伝子分布に注目したKimらの研究において記述されている68。 残念ながら、rs291593 DPYDの影響、生存率や治療反応性との相関に関する文献データはない。

最後に、我々の分析した患者群では、多型rs1054899 AG/AA ALDH5A1はFAC化学療法に対する反応性低下と相関していた。 ALDH5A1はシクロホスファミドの代謝経路の構成要素である。 この酵素の欠損は、GABA分解経路の重大な遺伝子変異に関連した酵素の欠損により、GABAとγ-ヒドロキシ酪酸（GHB）の両方が連続して上昇する稀な常染色体劣性遺伝の神経疾患である71,72,73,74,75。 神経伝達経路とは別に、ALDH5A1はALDH1A1、3A1と並んでシクロホスファミドの変換に関与し、アルドホスファミドを不活性なカルボキシホスファミドに無毒化することを誘導している76。 シクロホスファミドの代謝物の形成における個人差は、代謝反応を触媒する遺伝子の多型やその発現の変化から生じることが広く認められている77。 ALDH5A1 の調節性 3′UTR 変異がシクロホスファミド活性に与える正確な影響に関するデータは不足していますが、酵素の発現と治療予後の関連を示唆する報告があります。 Tianのグループは、ALDH5A1の低発現が卵巣がん（OC）の予後不良の優れた予測因子であり、卵巣がんの進行に重要な役割を果たす可能性を報告した。 ALDH5A1の発現と予後との正の相関は、卵巣癌患者の早期および進行期において見出されました。 卵巣がんのグレードII/IIIでは、ALDH5A1のmRNAレベルが高いことがOS78の改善と関連していました。 中国のてんかん患者を対象とした研究では、ALDH5A1遺伝子のrs1054899が、抗けいれん作用を持つバルプロ酸（VPA）の薬物動態に関与している可能性が確認されています79。

我々の解析では、OSとPFSの短縮、死亡と進行の高いリスクは、最大寸法20mm以上の腫瘍サイズ（すなわち、T1以上のT成分）、浸潤した局所リンパ節（すなわち、N0以外のN成分）、遠隔転移の存在（M1）といった進行性疾患の結果であった。 これらの観察は、乳癌の段階的な進行に関する従来の認識、すなわち、まだ広がっていない小さな腫瘍から、より侵攻性の高い大きな腫瘍へという認識と一致する80。 腫瘍の大きさ（T成分）は、治療に対する反応性の最も重要な要因の一つと考えられている。 Goortsらの研究81では、ネオアジュバント化学療法後の乳がん患者群において、臨床腫瘍サイズ（cT）が、残存がんがないとされる病理学的完全奏効（pCR）の達成を最も強く予測する因子であったとされている。 この研究では、グレードやプロゲステロン、エストロゲン受容体、HER2の状態とは無関係に、cTステージが高いほどpCR率が強く、有意に低いことが示されました。 また、最新版のCancer Staging Manual82では、乳がんのTNMステージングシステム全体は、主腫瘍を取り囲む小さなサテライト病巣を含めず、腫瘍塊の最大寸法で記述した総腫瘍体積の推定値であることが確認されています83。 最新のガイドラインによると、リンパ節の分類は最大の腫瘍の沈着の大きさで行われ、浸潤したリンパ節の合計が最終的なN値となる82。 一般に、リンパ節転移の大きさは患者の予後の悪化に反映され、特に生存時間の短縮に見られる84。 同様に、遠隔転移の有無、位置、広がりは、明らかに予後不良の原因であり、乳がん関連死亡の90％は転移播種によるものと推定されている85。 このような劇的な相関は、我々の解析でも見られ、遠隔転移の存在は、統計的にも最も強い生存率低下因子であった。 この状況は、原発巣と二次巣の間で治療反応率を変える臨床的・生物学的特徴に関する不一致を反映しているようである。 また、転移の広がりは、原発巣の位置、患者の年齢、さらに主腫瘍塊に対する外科的処置の予期せぬ影響と関連する複雑なパターンがあり、異なる臓器における休眠状態の微小転移の成長を促進する可能性がある85。

我々の研究では、乳癌のプロゲステロン受容体陰性の状態は、再発のリスクが高く、TFFSが短く、治療に対する反応がないことの決定要因であった。 PRとERの状態は，HER2発現や悪性度とは別に，乳癌の病期分類に組み込まれている生物学的要因の一つである。 このようなアプローチの目的は、最新の生物学的知識と最新の臨床研究を組み合わせることで、予後を可能な限り正確に定義する、シンプルかつ正確な病期分類ガイドラインを確立することにあります86。 乳癌におけるプロゲステロン受容体の発現の欠如は、近年、治療成績不良の要因として繰り返し報告されており、今回の結果と一致する。 Purdieらの研究では、ER陽性でリンパ節転移のないPR陰性のサブグループでも、化学療法の有無にかかわらず、乳がん特異的5年生存率が有意に短縮していた87。 この論文では、PRの発現がERよりも強力な独立した予後因子であることが示されている。 同様の結果は、van Mackelenberghらの研究でも得られており、ER陽性／PR陰性乳癌は、ネオアジュバント化学療法後の長期生存率は有意に低下するものの、治療に対する初期反応は良好であった88。 ホルモン受容体の状態が治療成績に及ぼす影響の複雑さは、エストロゲン受容体とプロゲステロン受容体の間に存在するクロストーク機構から生じている可能性がある。 PRが存在しない場合、エストロゲン受容体は特定の補因子を集め、クロマチン中のエストロゲン応答要素に結合する。 その結果、細胞増殖につながる経路が活性化される89。 このようなクロストークは、乳癌においてPRがERの挙動を調節し、その発現がER機能のマーカーとして見られることを指摘したMohammedらの研究において示されている

遺伝的因子と臨床因子の解析は、死亡、疾患の進行、再発、後発乳癌の発生および全治療効果に関して、予後の類似するより均一なグループへの患者の事前選択を行うための複合遺伝・臨床モデルの確立に役立つ可能性がある。 そのために、累積分析を行い、ある設定において最も多くの不利な因子を持つ、予後が最悪と思われる患者群を選択した。 それぞれの解析で、臨床的な要素から病気の進行が指摘された。 さらに、遺伝的修飾因子を加えると、その図式は完成する。 遺伝子変異が遺伝子やタンパク質の機能に及ぼす正確な影響に関するデータがしばしば欠如しているため、累積モデルの解釈には十分な注意が必要である。 それにもかかわらず、OSと死亡の最も高いリスクは、進行したTNMステージの明らかな結果であったが、このモデルにおけるドキソルビシントランスポーターSLC22A16の2つの変異体の存在は、細胞への最適な薬剤流入の重要性を強調するものである。 さらに、OSモデルにおける主要な解毒スイッチNR1/2の活性は、死亡リスクを媒介する役割を担っているようである。 この点から、治療効果の悪化は、FAC薬剤の解毒経路が過活動となり、薬剤の治療濃度が低下していることの反映であると考えられる。 7248>

癌の進行に関して最も予後が悪いグループは、病気の進行（転移）とドキソルビシンインポーター遺伝子SLC22A16の多型変異によっても特徴づけられる。 しかし、このモデルでは、プロゲステロン受容体遺伝子の2つのSNPsの存在によって、その図式が完成された。 このような「ダブルヒット」は、OS解析のSLC22A16と同様に、プロゲステロンの生理・代謝・シグナル伝達経路と乳癌細胞の転移能、および休眠状態の微小転移巣の復活との関係を指摘するものであった。 プロゲステロンのシグナル伝達経路は、がん細胞におけるPR受容体の陰性化として捉えられ、無再発生存率解析において最悪のシナリオを構成する要素としても浮上した。 しかし、この状況では、高い再発リスクは、5-フルオロウラシルカタボライザーDPYDと、ドキソルビシンとプロゲステロンの両方の代謝機構の構成要素であるAKR1C3の修正に同時に依存していた。 この結果は，治療薬の最適濃度を保証するプロゲステロンのシグナル伝達と解毒装置の活性の重要性を改めて強調するものである。

我々の知る限り，乳癌の治療効果全般に関するADME遺伝子の3′UTR多型の予後価値を評価した最初の研究である。 しかし，今回の解析では，高リスク因子としての臨床的決定要因が遺伝的決定要因を圧倒していた。 当然のことながら、PR腫瘍陰性の状態は、外科的処置の欠如（これは患者の状態の悪さの直接的な結果である）と共に、死亡、進行、再発、別の乳癌の発生などの否定的な事象の予測因子であることが示された。 このモデルにおける唯一の遺伝的要素であるALDH5A1の変異は、シクロホスファミドの異化機構を指摘している。 さらに、このモデルの強さは、TFFS解析の結果によって裏付けられています。 この研究では、化学療法開始後10ヶ月以内に本来の治療効果が得られると推定していますが、得られた不利な要因の数によって患者をグループに分けることで、長期生存を予測することが可能になりました。 この解析の結果、予後良好群と予後不良群の間で生存期間中央値が14倍以上減少するという前例のない結果を報告した。

結論として、集団に一般的に存在する正常生殖細胞変異は、治療への反応を決定する重要な要因であることがわかった。 本研究では，多型は乳癌女性の生存の独立した予後予測因子であることが示された。 さらに、複数の好ましくない遺伝的因子と臨床的因子の集積が、生存予後不良と全治療反応に影響を及ぼすことも観察された。 この結果は、生殖細胞多型がドキソルビシンの薬物動態に影響を与えることを示唆している。 本研究では、全生存期間、無増悪生存期間とドキソルビシン輸送に関与するSLC22A16遺伝子の遺伝子多型との間に最も強い関連性があることを示している。 また、ドキソルビシン代謝経路に関与するAKR1C3遺伝子のSNPは無再発生存率に影響を与えることがわかった。 要約すると、FACレジームで治療されたポーランド人女性乳癌患者において、遺伝的・臨床的な有害因子の存在は、治療反応性不良のリスクを高めるということである。 本研究は、累積的な不利な要因モデルに基づく患者の選択が、死亡、進行または再発に関する予後の予測に有用であることを示唆している

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