In deze studie, onderzochten we de associatie tussen de 3′UTR SNPs van genen betrokken bij het transport van FAC-medicijnen, metabolisme, regulatie van ontgiftingswegen, nucleaire receptoren, klinische parameters en de algehele respons op FAC-chemotherapie. De resultaten suggereren dat het risico op overlijden, ziekteprogressie of recidief van borstkanker wordt gewijzigd door genetische varianten van nucleaire receptoren (NR1/2, PGR), genen betrokken bij de belangrijkste metabolische route van doxorubicine (SLC22A16) en doxorubicine-progesteron-gerelateerd gen (AKR1C3). SNPs in DPYD en ALDH5A1 genen waren significant geassocieerd met het verhoogde risico op RFS en behandelingsrespons/TFFS analyses. De klinische prognostische factoren die de overleving en behandelingsrespons in onze studie beïnvloedden, hebben zich in drie categorieën gegroepeerd – de componenten van TNM stadiëring in OS en PFS, tumor progesteron receptor status in RFS en behandelingsrespons/TFFS analyses, en de uitvoering van chirurgische procedures (ongeacht de omvang ervan) in behandelingsrespons/TFFS analyses.

De familie van PXR speelt een regulerende functie met betrekking tot enzymen van de I-fase (cytochroom P450-enzymen CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9, en CYP2C19), fase II-enzymen (UGT1A1, UGT1A2, SULT2A) en fase III-transporters (ABCB1, OAT’s, MRP3)37,38,39,40,41,42. 3′UTR van de pregnane X receptor (NR1/2/PXR2), een sleutelcomponent van de xenobioticasensor, zijn doelwitten voor de aanwezigheid van verschillende microRNAs, waaronder miR-362-5p, miR-500b-5p en miR-501-5p, wat wijst op het belang van epigenetische regulatie van NR1/2 expressie21. Onze waarnemingen van de correlaties tussen de 3′UTR genetische variant van het genoemde gen en de overleving van patiënten lijken deze verklaring te ondersteunen, hoewel de precieze genetisch-klinische koppeling nog moet worden bevestigd. Reuter en collega’s zochten naar een dergelijke correlatie, en hoewel zij een invloed aantoonden van NR1/2 polymorfismen op de eiwitexpressie in bloed- en weefselmonsters van patiënten met plaveiselcelcarcinoom van hoofd en nek (HNSCC), konden zij hun invloed op de totale overlevingstijd niet aantonen43.

Ondanks de inconsistentie van de onderzoeksresultaten is het aannemelijk dat genetische variaties binnen NR1/2 die de eiwitexpressie of -activiteit beïnvloeden, significante klinische effecten van uiteenlopende aard hebben38. SNPs binnen de coderende sequentie van het NR1/2 gen zijn gecorreleerd met het risico van kanker in het algemeen44, progressie van AIDS45, waren de potentiële risicofactor van resistentie tegen medicijnen bij epilepsie46 evenals van hematologische toxiciteit geïnduceerd door irinotecan bij colorectale kankerpatiënten47. Genetische varianten in de 3′UTR regio van NR1/2 beïnvloeden het transport, de lokalisatie en de stabiliteit van NR1/2 mRNA14,40. Verschillende studies hebben de invloed van de 3′UTR SNPs van NR1/2 op de behandelingseffecten bevestigd, met als gevolg een toename van de resistentie tegen chemotherapie, ook bij borstkankerpatiënten39,40,41,42. De groep van Oleson associeerde rs3732359 en rs3732360 van NR1/2 met een hogere CYP3A activiteit in vivo. CYP3A4 is het belangrijkste geneesmiddel-metaboliserende enzym en het downstream effector gen van NR1/2. Bovendien vonden Oleson et al. dat de varianten rs3732359 en rs3732360 van NR1/2 een hogere mediane orale midazolamklaring vertoonden in vergelijking met homozygote referentiegenotypes voor deze SNPs38. In onze groep patiënten was de aanwezigheid van rs3732359 AA NR1/2 een onafhankelijke voorspeller van OS. In univariate analyses vertoonden dragers met genotype AA een bijna 2-voudige toename van het risico op overlijden in vergelijking met patiënten NR1/2 rs3732359 AG/GG. Die waarneming suggereerde associatie van rs3732359 AA NR1/2 met slechtere overlevingsprognose bij vrouwen met borstkanker die met FAC-chemotherapie werden behandeld. Observaties vergelijkbaar met de onze werden gerapporteerd in de studie van Swart et al. waar rs3732359 allel A NR1/2 de patiënten onderscheidde in subgroepen volgens geneesmiddel disproportie en therapie respons21. Dit resultaat was in overeenstemming met de waarnemingen van Chew et al. dat rs3732359 NR1/2 geassocieerd was met een significante verlaging in nadir hemoglobine, bloedplaatjes en/of absoluut neutrofielengetal (ANC) vanaf de baseline in cyclus 1, afhankelijk of onafhankelijk van de effecten op de farmacokinetiek van docetaxel bij patiënten met nasofaryngeale kanker48. Deze resultaten suggereren het effect van rs3732359 op de hematopoietische capaciteit van het beenmerg, en het vermogen om ontgiftingsmechanismen in werking te stellen in aanwezigheid van xenobiotica.

In onze studie was er een duidelijke associatie van polymorfismen binnen SLC22A16 gen betrokken bij doxorubicine transport met het risico van overlijden en ziekteprogressie. Ota et al. en Faraji et al. schoven aan dat polymorfismen binnen SLC22A16 de systemische farmacodynamiek van op doxorubicine gebaseerde chemotherapie beïnvloedden49,50. In onze studie hebben dragers rs7756222 CC en rs9487402 TG/GG SLC22A16 een verlaagde OS. Bovendien was de variant rs7756222 CC SLC22A16 de onafhankelijke factor die de PFS verkortte. Onze resultaten zijn consistent met de resultaten van Lal et al. 2007, dat SNPs in SLC22A16 geassocieerd zijn met een kortere OS en PFS bij Aziatische borstkankerpatiënten51. Bovendien bevestigden eerdere studies de associatie van SNPs in SLC22A16 met toxische bijwerkingen van chemotherapie bij borstkankerpatiënten36,50,52. Bovendien wordt overexpressie van SLC22A16 in kankercellen geassocieerd met een toenemende instroom van doxorubicine in de cel en correleert dit met een verhoogde gevoeligheid voor de cytotoxische effecten van dit geneesmiddel53. Bij patiënten met maagkanker voorspelde SLC22A16 upregulatie onafhankelijk een slechte OS en RFS, bij vroege maagkanker en een slechte OS bij gevorderde maagkanker54. Kunii et al. toonden ook aan dat SLC22A16 een bemiddelaar is van platinum opname in kankercellen, en down-regulatie van SLC22A16 is mogelijk één van de mechanismen van resistentie tegen cisplatine in longkanker55. De geciteerde rapporten bevestigen dat de genetische varianten binnen het SLC22A16 gen de invoerefficiëntie van chemotherapeutische geneesmiddelen in de cel beïnvloeden, terwijl toxiciteit gegenereerd door het veranderde drugniveau in de cel corroondeert met de slechtste behandelingsrespons.

We presenteren twee onafhankelijke genetische prognostische factoren die het risico van verkorte PFS (rs1824125 GG en CC rs11224560 van PGR) en RFS (rs3209896 AG AKR1C3) bij borstkankerpatiënten significant beïnvloedden. Voor zover wij weten, is dit het eerste verslag van de mogelijke interacties van zowel rs1824125 GG en rs11224560 CC progesteronreceptor als rs3209896 AG AKR1C3 (progesteron-gerelateerd gen) met de overleving en behandelingsrespons. Jammer genoeg ontbreken de functionele gegevens voor PGR’s rs1824125 en rs11224560, maar de positie van de bestudeerde varianten in de genregulerende sequenties wijst op hun vermoedelijke rol in de expressiecontrole. Het is algemeen bekend dat de gecontroleerde expressie van de progesteronreceptor cruciaal is voor de ontwikkeling van het borstweefsel, temeer daar het PGR-gen twee promotors en translationele startpunten heeft en twee isovormen produceert, PR-A en PR-B. PR-B is de positieve regulator van de effecten van progesteron, maar PR-A antagoniseert de effecten van PR-B56. Een evenwichtige expressie van beide PR-isovormen is vereist voor de instandhouding van de borstklierfunctie, en een verstoring van het evenwicht wordt in verband gebracht met een verhoogd risico op borstkanker. In dit verband werd aangetoond dat een veranderde PR-A en PR-B balans de progesteron effecten op borstcellen verstoort, waardoor het risico op borstkanker toeneemt57.

In deze studie presenteerden wij de mogelijke relatie tussen het risico van lokaal recidief en de rs3209896 AG variant in AKR1C3. AKR1C3 is een fase I geneesmiddel-metaboliserend enzym dat betrokken is bij resistentie tegen chemotherapeutica, waaronder doxorubicine58. Het speelt een belangrijke rol bij de deactivering van doxorubicine tot doxorubicinol, een minder actieve metaboliet59. Polymorfismen in AKR1C3 werden bestudeerd als risicofactoren voor long-, prostaat-60, lymfoom61 en blaaskanker62. Er zijn ook rapporten over de rol van AKR1C3 variatie in het risico van ziekteprogressie en mortaliteit bij B-cel non-Hodgkin lymfoom63, alsook in de modulatie van behandelingstoxiciteit en overlevingstijd bij borstkankerpatiënten58. De invloed van het rs3209896 polymorfisme op het kankerrisico en de respons op chemotherapie werd echter slechts in twee eerdere studies onderzocht, maar zonder succes. In de eerste, Aziatische borstkankerpatiënten behandeld met doxorubicine-bevattende chemotherapie, werd geen correlatie aangetoond tussen rs3209896 AG AKR1C3 met chemotoxiciteit, PFS en OS58. In de tweede studie brachten genetische analyses van het AKR1C3 gen door moeder en nakomelingen geen associatie aan het licht van rs3209896 AKR1C3 in verband met het risico op leukemie bij kinderen61. In onze studie bestond daarentegen wel een genetisch-klinische koppeling met betrekking tot het resultaat bij borstkankerpatiënten die werden behandeld met een doxorubicine-bevattend FAC-regime. Eerdere studie suggereerde dat AKR1C3 behoort tot de familie van progesteron-gerelateerde genen die betrokken zijn bij het prereceptormetabolisme van progesteron en veronderstelde dat het een zwakkere activator van PGR is64. Gezien deze gegevens, benadrukken onze resultaten verder het klinische belang van progesteron signaleringswegen. Onderzoek door Reding et al. toonde aan dat de variatie in AKR1C2 en AKR1C3 genen het risico op borstkanker kan verhogen bij vrouwen die oestrogeen-progesteron therapie hebben gebruikt65. Een vermeende rol in borstkanker gebaseerd op de AKR1C enzymen die progesteron metaboliseren tot een 4-pregneen werd beschreven door Ji et al. Deze auteurs speculeerden dat verlies van AKR1C1 en AKR1C2, maar niet AKR1C3 in borstkanker, resulteerde in verminderd progesteronkatabolisme dat, in combinatie met verhoogde PR-expressie, de progesteronsignalering door de nucleaire receptoren kan versterken64.

In onze studie hadden de dragers van rs291593 CC DPYD een hoger risico op ziekteherhaling. DPYD kataboliseert 5-fluorouracil (5-FU), dat algemeen wordt gebruikt voor de behandeling van vaste carcinomen66,67,68, en is ook de component van FAC regime. Een afname van de enzymactiviteit kan leiden tot een verlenging van de halfwaardetijd van 5-FU en een verhoogd risico op dosisafhankelijke toxiciteit67,68,69,70. De SNP rs291593 CC DPYD werd beschreven in de studie van Kim et al., die zich richtte op de verdeling van allelen bij 150 Koreaanse proefpersonen68. Helaas zijn er geen literatuurgegevens over het effect van rs291593 DPYD en de correlatie met de overleving en de respons op de behandeling.

Ten slotte, in onze geanalyseerde groep patiënten correleerde het polymorfisme rs1054899 AG/AA ALDH5A1 met slechtere respons op de FAC chemotherapie. ALDH5A1 is een onderdeel van de cyclofosfamide metabolische route. Een deficiëntie van dit enzym is een zeldzame autosomaal recessieve neurologische aandoening waarbij een ernstig aan genmutatie gerelateerd enzymdefect in de GABA-afbraakroute een opeenvolgende verhoging van zowel GABA als gamma-hydroxyboterzuur (GHB)71,72,73,74,75 veroorzaakt. Naast de neurotransmitterende routes neemt de ALDH5A1, samen met de ALDH1A1 en 3A1, deel aan de omzetting van cyclofosfamide, waarbij de ontgifting van aldofosfamide naar inactieve carboxyfosfamide wordt geleid76. Algemeen wordt aangenomen dat interindividuele verschillen in de vorming van cyclofosfamidemetabolieten het gevolg kunnen zijn van polymorfismen in genen die metabole reacties katalyseren, en van veranderingen in de expressie van die genen77. Hoewel de gegevens over de exacte invloed van de ALDH5A1 regulerende 3′UTR variatie op de cyclofosfamide activiteit ontbreken, zijn er rapporten die wijzen op een verband tussen de expressie van het enzym en de prognose van de behandeling. De groep van Tian rapporteerde dat lage ALDH5A1 expressie een uitstekende voorspellende factor is voor slechte prognose bij eierstokkanker (OC) en mogelijk een cruciale rol speelt in de progressie van eierstokkanker. De positieve associatie tussen expressie van ALDH5A1 en prognose werd gevonden in vroege en gevorderde stadia van ovariumkankerpatiënten. In graad II/III van ovariumkanker werd een hoog mRNA niveau van ALDH5A1 geassocieerd met een verbeterde OS78. Studies uitgevoerd bij Chinese epilepsiepatiënten bevestigden dat rs1054899 van het ALDH5A1 gen een rol kan spelen in de farmacokinetiek van valproïnezuur (VPA) met anticonvulsieve eigenschappen79.

In onze analyses waren de verkorte OS en PFS, en het hoge risico op overlijden en progressie, het gevolg van gevorderde ziekte- tumorgrootte van meer dan 20 mm in grootste afmeting (d.w.z. T-component groter dan T1), geïnfiltreerde regionale lymfeklieren (d.w.z. N-component anders dan N0) en de aanwezigheid van verre metastasen (M1). Deze waarnemingen zijn in overeenstemming met de traditionele opvatting van de stapsgewijze progressie van borstkankers, van kleine, nog niet uitgezaaide tumoren, tot grotere, agressievere tumoren80. De grootte van de tumor (T-component) wordt gezien als een van de meest cruciale factoren voor de respons op behandeling. In de studie van Goorts et al.81 was de klinische tumorgrootte (cT) de sterkste voorspeller van het bereiken van de pathologische complete respons (pCR), gezien als de afwezigheid van residuele kanker, in de groep borstkankerpatiënten na neoadjuvante chemotherapie. In deze studie hadden hogere cT-stadia sterk, significant lagere pCR-percentages, onafhankelijk van graad en progesteron-, oestrogeenreceptor- en HER2-status. Ook de nieuwste, achtste editie van het Cancer Staging Manual82 bevestigt dat het hele TNM-stadiëringssysteem voor borstkanker de schatting is van het totale tumorvolume, beschreven door de maximale afmeting van de tumormassa, zonder rekening te houden met bijkomende kleine satelliethaarden rond de hoofdtumor83.

De aanwezigheid van regionale lymfekliermetastasen is een andere erkende factor van slechtere prognose bij borstkankerpatiënten. Volgens de nieuwste richtlijnen wordt de classificatie van de knopen gemaakt op basis van de grootte van de grootste tumorafzetting, en de som van de geïnfiltreerde lymfeklieren resulteert in de uiteindelijke N-waarde82. Over het algemeen wordt de mate van betrokkenheid van de lymfeklieren weerspiegeld in een verslechtering van de prognose van de patiënten, onder andere gezien in een kortere overlevingstijd84. Evenzo zijn de aanwezigheid, de plaats en de omvang van verre metastasen ondubbelzinnig verantwoordelijk voor een slechte prognose, waarbij naar schatting 90% van de sterfgevallen ten gevolge van borstkanker te wijten is aan metastatische verspreiding85. Een dergelijke drastische correlatie werd ook gezien in onze analyses, waar de aanwezigheid van verre metastasen de sterkste, ook statistisch gezien, overlevingsverlagende factor was. Deze situatie lijkt een weerspiegeling te zijn van de discordanties tussen de primaire en secundaire tumoren wat betreft de klinische en biologische kenmerken die de behandelingsrespons tussen deze plaatsen veranderen. Ook zijn er ingewikkelde patronen die de metastatische verspreiding in verband brengen met de plaats van de primaire massa, de leeftijd van de patiënten en ook met de onvoorziene invloed van chirurgische ingrepen op de hoofdtumormassa, die de groei van sluimerende micrometastasen in verschillende organen kan versterken85.

In onze studie was de borstkanker negatieve status van progesteronreceptor de determinant van hoog risico op recidief, kortere TFFS en gebrek aan respons op behandeling. De status van PR, oestrogeen receptoren (ERs) behoren tot de biologische factoren, naast HER2 expressie en graad, die zijn opgenomen in het borstkanker stadiëringssysteem. Het doel van een dergelijke benadering was de meest recente biologische kennis te combineren met het meest recente klinische onderzoek in de hoop een eenvoudige maar nauwkeurige richtlijn voor de stadiëring vast te stellen die de prognose met de grootst mogelijke precisie bepaalt86. Het ontbreken van progesteronreceptorexpressie in borstkanker is de laatste jaren herhaaldelijk gerapporteerd als de factor voor een slecht behandelingsresultaat, hetgeen in overeenstemming is met onze resultaten. In het werk van Purdie en anderen had de groep PR-negatieve patiënten, zelfs de subgroepen die anders een goede prognose zouden hebben – d.w.z. ER-positief en zonder lymfeklierinfiltratie, een significant kortere 5-jaars borstkankerspecifieke overleving, met of zonder toepassing van chemotherapie87. In het geciteerde werk was de PR expressie de onafhankelijke prognostische factor, krachtiger dan de ER status. Gelijkaardige resultaten kwamen uit de studie van van Mackelenbergh et al., waar de ER-positieve/PR-negatieve borstkankers een betere initiële respons op de behandeling vertoonden, ook al was uiteindelijk de lange termijn overleving na neoadjuvante chemotherapie significant verminderd88. De complexiteit van de invloed van de hormoonreceptorstatus op het resultaat van de behandeling zou kunnen voortvloeien uit de bestaande mechanismen van kruisbestuiving tussen oestrogeen- en progesteronreceptoren. Wanneer de PR afwezig is, rekruteert de oestrogeenreceptor specifieke cofactoren en bindt zich aan oestrogeenresponselementen in het chromatine. Het resultaat is de activering van trajecten die tot celproliferatie leiden89. Een dergelijke wisselwerking werd geïllustreerd in het werk van Mohammed et al.90, die erop wezen, dat bij borstkanker PR het gedrag van ER moduleert, en de expressie ervan kan worden gezien als een marker van ER functie.

De analyses van genetische en klinische factoren zouden nuttig kunnen zijn in de poging om de complexe gecombineerde genetisch-klinische modellen op te stellen voor de voorselectie van de patiënten in meer uniforme groepen met een vergelijkbare prognose met betrekking tot overlijden, ziekteprogressie, recidief, ontwikkeling van metachronische borstkanker en algemene behandelingsrespons. Daartoe voerden wij cumulatieve analyses uit en selecteerden wij de groepen van patiënten met de schijnbaar slechtste prognose, die het hoogste aantal ongunstige factoren in een bepaalde setting droegen. Bij elk van de analyses wees de klinische component op het voortschrijden van de ziekte. Het beeld werd verder vervolledigd door de toevoeging van genetische modifiers. Wegens het frequente gebrek aan gegevens over de exacte impact van de bestudeerde genetische variant op de gen- of eiwitfunctie, moet elke interpretatie van het cumulatieve model met grote voorzichtigheid gebeuren. Niettemin was de OS en het hoogste risico op overlijden het duidelijke gevolg van gevorderde TNM stadia, maar de aanwezigheid van twee varianten in doxorubicine transporter SLC22A16 in dit model benadrukken het belang van een optimale toevoer van het geneesmiddel naar de cellen. Bovendien lijkt de activiteit van de belangrijkste ontgiftingsschakelaar NR1/2 in het OS-model een rol te spelen bij de mediëring van het overlijdensrisico. We zouden kunnen veronderstellen dat de slechtere behandelingsrespons in dit verband het gevolg kan zijn van overactieve ontgiftingsroutes van een van de FAC-geneesmiddelen, waardoor de therapeutische concentratie van de geneesmiddelen daalt. Er zij op gewezen, dat de kracht van dit model nog wordt vergroot door het ontbreken van sterftegevallen in de groep van niet-dragers van hoog-risico factoren.

De groep met de slechtste prognose wat betreft kankerprogressie werd ook gekenmerkt door de ziekteprogressie (metastasen) en polymorfe variant in doxorubicine importer gen SLC22A16. In dit model werd het beeld echter gecompleteerd door de aanwezigheid van twee SNPs in het progesteronreceptorgen. De “double hit” als zodanig, net als voor de SLC22A16 in de OS analyse, wijzen op de relaties tussen fysiologische, metabole en signaleringsroutes van progesteron en het metastatisch vermogen van borstkankercellen, alsmede de herleving van slapende micrometastasen. De progesteron signaleringsroutes, gezien als de negatieve PR receptor status in kankercellen, kwamen ook naar voren als de component van het slechtst denkbare scenario in de analyse van de recidiefvrije overleving. In deze situatie was het hoge risico van recidief echter tegelijkertijd afhankelijk van de wijziging in 5-fluorouracil katabolisator DPYD, alsmede in AKR1C3, de component van zowel doxorubicine als progesteron stofwisselingsmechanismen. Dit resultaat benadrukt nogmaals het belang van progesteron signalering en de activiteit van ontgiftingsmachines, die de optimale therapeutische drugsconcentratie verzekeren.

Voor zover wij weten, is dit de eerste studie die de prognostische waarde evalueert van 3′UTR polymorfismen van ADME genen in de context van de algemene behandelingsrespons bij borstkanker. Echter, de klinische determinanten als hoge risicofactoren overheersten de genetische in deze analyse. Het zal geen verbazing wekken dat de resultaten aantoonden dat PR tumor negatieve status, samen met het gebrek aan chirurgische procedures, wat op zijn beurt het directe gevolg is van de slechte conditie van de patiënt, de voorspellers zijn van negatieve gebeurtenissen zoals overlijden, progressie, recidief en de ontwikkeling van een andere borstkanker. De enige genetische component in dit model, variant in ALDH5A1, wijst op de cyclofosfamide katabole mechanismen. Bovendien wordt de kracht van dit model ondersteund door de resultaten van TFFS-analyse. Hoewel de oorspronkelijke behandelingsrespons in dit werk werd geschat binnen 10 maanden na het begin van de chemotherapie, maakte de verkregen scheiding van patiënten in groepen met betrekking tot het aantal ongunstige factoren het mogelijk de overleving op lange termijn te voorspellen. Na deze analyse melden wij de ongekende, meer dan 14-voudige vermindering van de mediane overleving tussen de groepen met de beste en de slechtste prognose.

In conclusie zijn de normale kiembaanvarianten die algemeen in de bevolking aanwezig zijn, belangrijke factoren die de respons op de behandeling bepalen. De studie toont aan dat polymorfismen een onafhankelijke prognostische voorspellende factor zijn voor de overleving bij borstkanker vrouwen. Bovendien observeerden we het effect van de opeenstapeling van meerdere ongunstige genetische en klinische factoren op de slechte overlevingsprognose en de totale behandelingsrespons. De resultaten suggereren dat germline polymorfismen de farmacokinetiek van doxorubicine beïnvloeden. Onze studie toont de sterkste associaties aan tussen algemene overleving, progressievrije overleving en genetische polymorfismen in SLC22A16-gen betrokken bij doxorubicinetransport. Bovendien heeft een SNP in AKR1C3, een gen dat betrokken is bij het doxorubicinemetabolisme, een effect op de recidiefvrije overleving. Samenvattend, de aanwezigheid van ongunstige genetische en klinische factoren verhoogt het risico van een slechte uitkomst van de behandeling respons bij Poolse vrouwen met borstkanker die werden behandeld met FAC regime. Deze studie impliceert dat selectie van patiënten op basis van de cumulatieve ongunstige factoren modellen nuttig kan zijn bij het voorspellen van de prognose met betrekking tot overlijden, progressie of recidief.