Myszy

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt i wszystkie prace na myszach zostały zatwierdzone przez Animal Care and Use Committee of China Agriculture University (numer pozwolenia: SKLAB-2016-01-04). Myszy CD1 i 129 uzyskano z Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Myszy Actin-GFP uzyskano z laboratorium Shaorong Gao w Tongji University. Wszystkie myszy były utrzymywane w specyficznych warunkach wolnych od patogenów (SPF) z 12-h cyklem ciemnym / 12-h cyklem świetlnym między 06:00 a 18:00 w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (22 ± 2 ° C) ze swobodnym dostępem do wody i żywności.

Linie komórek macierzystych i hodowla komórkowa

G4 i G4-ACTB-DsRed-MST ESCs otrzymano od dr Andrasa Nagy, Kristiny Vintersten i Mariny Gertsenstein’s Laboratory w Mount Sinai Hospital & the Samuel Lunemfeld Research Institute. Blimp1-mVenus i Stella-ECFP (BVSC) podwójnie transgeniczna linia ESC, wyrażająca błonowo ukierunkowaną Wenus (mVenus) pod kontrolą elementów regulatorowych Prdm1 (Blimp1) i wzmocnione CFP (ECFP) pod kontrolą Dppa3 (Stella/Pgc7), zostały uzyskane od dr Mitinori Saitou45,46.

Do generacji mysiej linii komórkowej XEN Lefty1-mCherry, promotor Lefty1 i białko fluorescencyjne zostały użyte do integracji z komórkami XEN przez system transpozonowy Sleeping Beauty, który składa się z dwóch komponentów: wektora transpozonowego zmodyfikowanego z pT2/LTR7-GFP (addgene#62541) i wektora transpozazy (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879). Do PT2/LTR7-GFP dodawano zamek „puro”, umożliwiający ekspresję N-acetylotransferazy puromycyny, a region CDS GFP zastępowano mCherry. Fragment DNA, który amplifikowano z pT2/LTR7-GFP przy użyciu primera PT2-F (GTTTGGACAAACCACAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACATCATTTTCTG), sprzężono z zamkiem „puro” i regionem CDS mCherry w celu uzyskania wektora o nazwie PT2-Puro-mCherry przy użyciu NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs). Sekwencja promotorowa genu Lefty1 została amplifikowana z DNA mysich komórek ES przy użyciu Lefty1-F (GTCCGGTGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTTGAGTCTGCGG). Następnie sekwencję promotorową genu Lefty1 dodawano do PT2-Puro-mCherry za pomocą NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs), w którym PT2-Puro-mCherry linearyzowano przez EcoRI, a sekwencję nakładającą się zawierającą sekwencję EcoRI dodawano do sekwencji promotorowej genu Lefty1. Wektor ten nazwano PT2-Puro-mCherry-Lefty1. Następnie PT2-Puro-mCherry-Lefty1 i pCMV(CAT)T7-SB100 transfekowano do mysich komórek XEN i przesiewano przez 2 μg na mL puromycyny do dalszych analiz.

Do generacji linii komórkowych nokautujących Lamc1 (laminina, gamma 1) użyto dwóch sekwencji sgRNA ukierunkowanych na egzon1 Lamc1 (GGAGTACTGCGTGCAGACTGGGG i GCTTGCCACCAGGTGTGTCG) w celu skonstruowania podwójnego wektora sgRNA. Fragmenty zawierające dwie sekwencje sgRNA amplifikowano z PUC-U6-sgRNA-Kana (z laboratorium Huang Xingxu) przy użyciu starterów (Lamc1sg1-F: atgcgtctcaccgggagtactgcggtagcagactgttagctagaaatagcaag i Lamc1sg2-R: atgcgtctcgaaacaccacctggtggcaaagcgtgtcgtcccacaag). Produkt PCR trawiono za pomocą BsmbI i ligowano z linearyzowanym PX330-GFP. Wektory zostały transfekowane do ESCs i XENCs odpowiednio przy użyciu Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Następnie komórki GFP-pozytywne sortowano za pomocą cytometrii przepływowej i rozcieńczano do wzrostu monoklonalnego. Z otrzymanych komórek monoklonalnych ekstrahowano DNA, które poddawano amplifikacji PCR i sekwencjonowaniu. Komórki nokautujące zostały wybrane do dalszych eksperymentów.

Do generacji linii komórkowych nokautujących Nodal, do konstrukcji wektora sgRNA użyto sekwencji gRNA ukierunkowanych na (GCCCTCGTCACCGTCCCCTCTGG) egzon 1 Nodal. Podkłady dla sgRNA Nodala (Nodal-sgF: caccgccctcgtcaccgtcccctc i Nodal-sgR: aaacgagggggacgggagggc) zostały znegowane, a znegliżowany produkt został zlinkowany do zlinearyzowanego PX330-GFP przez BbsI. Wektory transfekowano do ESCs przy użyciu Lipofectamine 3000, a komórki GFP-pozytywne sortowano przy użyciu cytometrii przepływowej i rozcieńczano do wzrostu monoklonalnego. Z uzyskanych komórek monoklonalnych ekstrahowano DNA, które poddawano amplifikacji PCR i sekwencjonowaniu. Knockout-pozytywne komórki wybrano do dalszych eksperymentów.

Do generacji linii ESC knockout p53, sekwencję sgRNA dla mutacji p53 sklonowano do wektora PX330-GFP (addgene, #48138) przy użyciu systemu CRISPR-Cas959. Wektor został transfekowany do G4 ESCs za pomocą Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Trzy dni po transfekcji, komórki GFP-pozytywne były sortowane i umieszczane na płytkach 6-dołkowych. Wybierano kolonie, a regiony nokautujące amplifikowano metodą PCR przy użyciu starterów (F: CATCCAGGCGGAAATAGAC; R: CCTGACTGTGTGTAAACTAGGC) i sekwencjonowano. Poprzez wyrównanie z sekwencją typu dzikiego, zidentyfikowano homozygotyczne kolonie komórek knockout i wybrano je do dalszych badań.

ESCs hodowano w Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) z 15% (v/v) FBS (Gibco, zakwalifikowane do komórek ES), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-merkaptoetanolu (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM non-essential amino acids (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM pirogronian sodu (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicylina-streptomycyna (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1000 IU LIF (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM PD0325901 (4423, Tocris) i 3 µM CHIR99021 (4192, Tocris). ESC były hodowane w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na żelatynowanych i pokrytych podajnikiem płytkach ze studzienkami do hodowli tkankowych, i przekazywane po osiągnięciu 80% konfluencji.

TSCs zostały wyprowadzone z blastocyst E3.5 wypłukanych z macicy 5-tygodniowej samicy myszy CD115,60. Blastocysty hodowano na inaktywowanych mitotycznie mysich komórkach MEF (komórki podścieliska) w podłożu do hodowli TSC: zaawansowane podłoże RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) uzupełnione 20% (v/v) FBS (Gibco, zakwalifikowane do komórek ES), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-merkaptoetanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM pirogronian sodu (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% (v/v) penicylina-streptomycyna (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng na mL rekombinowanego ludzkiego FGF4 (235-F4-025, R&D) i 1 µg na mL heparyny (07980, Stem Cell). Do momentu uformowania się wyrostków w 4. dniu, były one następnie dezagregowane przez inkubację w 0,1% trypsynie-EDTA przez 5 min w inkubatorze. Dodawano świeżą pożywkę kondycjonowaną mysimi 70% fibroblastami embrionalnymi, zawierającą FGF4 i heparynę, aby zatrzymać reakcję i ponownie umieszczano w inkubatorze. Wymieniać pożywkę co drugi dzień, dopóki nie będzie można zaobserwować kolonii komórek TSC, i zmieniać pożywkę z pożywką do hodowli TSC, aby utrzymać komórki. Linie komórkowe TSC wyrażające EGFP (TSC-EGFP) wyprowadzono z TSC typu dzikiego, które poddano transfekcji wektorem PB-UBC-EGFP za pomocą JetPrime (114-15, Polyplus transfection). TSCs hodowano w temperaturze 37°C i 5% CO2 na żelatynowanych i pokrytych podajnikiem płytkach z dołkami do hodowli tkanek i odstawiano, gdy osiągnięto 80% konfluencji. Podłoże hodowlane zmieniano codziennie.

XENCs wyprowadzono z blastocyst E3.5 wypłukanych z macicy 5-tygodniowej samicy myszy 129, stosując zmodyfikowane warunki XENC61. Blastocysty myszy hodowano na komórkach podajnika do momentu utworzenia wyrostka w 4. dniu, który następnie był dezagregowany przez inkubację w 0,1% trypsynie-EDTA przez 5 min w inkubatorze. Dodaj świeżą pożywkę dla mysich komórek ES bez PD0325901 i CHIR99021, aby zatrzymać reakcję i wymieniaj pożywkę co drugi dzień, dopóki nie będzie można zaobserwować kolonii komórek XEN. Kolonie komórek XEN były utrzymywane w standardowym podłożu XEN: zaawansowane RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) uzupełnione 15% (v/v) FBS (Gibco) i 0,1 mM β-merkaptoetanolu (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1% penicyliny-streptomycyny (15140122, Thermo Fisher Scientific). Linia komórkowa XENC-EGFP została wyprowadzona bezpośrednio z blastocysty mysiej Actin-EGFP. W celu hodowli bez karmienia, XENC były hodowane na płytkach do hodowli tkankowych pokrytych żelatyną. Komórki XEN były hodowane w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po osiągnięciu 90% konfluencji były usuwane. Podłoże hodowlane zmieniano codziennie.

Generacja zarodków samoprzylepnych

ESCs, które osiągnęły 80% konfluencji, przemywano raz PBS (14190-094, Gibco) i inkubowano przez 5 min w 37 °C w TrypLE (12605010, Thermo Fisher Scientific). TSCs i XENCs zostały zdysocjowane do pojedynczych komórek przez inkubację z 0,1% trypsyną-EDTA (25300054, Thermo Fisher Scientific) w temperaturze 37 °C. Komórki były granulowane przez wirowanie przy 1000 rpm przez 5 min. Osad był ponownie zawieszany w pożywce dla zrekonstruowanych zarodków przez pipetowanie do pojedynczych komórek. Komórki były liczone automatycznie za pomocą automatycznego licznika komórek.

Dla ETX-embryoidów, mieszano ESCs, TSCs i XNECs z liczbą komórek odpowiednio 1 × 105, 1 × 105 i 2 × 105 (dla ETS-embryoidów, mieszano ESCs i TSCs z liczbą komórek odpowiednio 1 × 105 i 1 × 105; dla zarodków EXE, zmieszać ESCs i XENCs z liczbą komórek odpowiednio 1 × 105 i 1 × 105) z 2 mL pożywki dla zrekonstruowanych zarodków na 35 mm niepoddaną obróbce szalkę do hodowli komórek. Przenieść szalkę na rotatory poziome w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 100% wilgotności. Prędkość obrotów wynosi 60 rpm na minutę. Pożywka dla zrekonstruowanych zarodków zawiera 39% zaawansowanego RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) i 39% DMEM (11960069, Thermo Fisher Scientific) z dodatkiem 17,5% FBS (Gibco, zakwalifikowany do komórek ES), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-merkaptoetanolu (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM non-essential amino acids (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM pirogronianu sodu (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicyliny-streptomycyny (15140122, Thermo Fisher Scientific). Codziennie wymieniano pożywkę z 2 mL świeżej pożywki dla zrekonstruowanych zarodków.

EXE-embryoidy tworzyły się konsekwentnie i wydajnie, eksperymenty funkcjonalne mogą być wykonywane bez selekcji regularnych lub nieregularnych struktur. Do eksperymentów funkcjonalnych ETX-embryoidów i ETS-embryoidów, wybraliśmy regularne struktury na podstawie ich morfologii, a także odpowiednie proporcje i pozycje przedziałów ESC i TSC poprzez wskazanie TSC-EGFP pod stereofonicznym mikroskopem fluorescencyjnym.

Odzyskiwanie zarodków typu Wild i hodowla in vitro

Blastocysty odzyskiwano z E4.5 superowulowanych ciężarnych samic myszy przez płukanie macicy za pomocą M2 (MR-015-D, Millipore). Hodowla zarodków w pożywce IVC po usunięciu muralnej trophektodermy in vitro na 8-dołkowych płytkach μ-Slides (80826, Ibidi)62. W celu odzyskania zarodków E5.5, E5.75 i E6.5, dysekcja zarodka mlecznego z macicy opisywana jest zgodnie z protokołem63. Dla EPI-eksplantów z myszy CD1 dokonano dysekcji w dniu E5.0, jak opisano wcześniej28 i hodowano z podłożem ETX-embryoidy in vitro.

Barwienie immunofluorescencyjne

Zarodki myszy i zrekonstruowane zarodki utrwalano 4% paraformaldehydem (DingGuo, AR-0211) w temperaturze 4 °C przez 20 min i przemywano trzykrotnie buforem przemywającym (PBS zawierający 0,1% Tween-20). Następnie zarodki permeabilizowano 0,5% Tritonem X-100 (H5142, Promega) przez 30 min w temperaturze pokojowej i inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi w buforze blokującym (3% BSA, 0,3% Triton X-100) przez noc w 4 °C. Po przepłukaniu w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał pierwszorzędowych, komórki inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C. Jądra komórkowe barwiono DAPI, po czym dwukrotnie przemywano buforem myjącym, a następnie montowano w Fluoroshield Mounting Medium with DAPI (104140, abcam). Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego Nikon A1.

Obrazy z przetwarzaniem i analizą

Obrazy zarodków mysich i zarodków zrekonstruowanych uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego Nikon A1 z obiektywem 20 × lub 40 ×. Wszystkie analizy przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ”Fiji” do analizy obrazów typu open-source. Objętość tkanek i liczbę komórek dla zrekonstruowanych zarodków i zarodków typu dzikiego oszacowano, a pomiary intensywności immunofluorescencji do analizy dystrybucji PCX wykonano również przy użyciu oprogramowania Fiji9.

High-throughput single-cell qPCR and data processing

Do izolacji pojedynczych komórek, niektóre komórki na różnych etapach rozwoju (0, 24, i 84 h) zostały zebrane z dwóch typów ETX-embryoidów, które zostały zrekonstruowane z Lefty1-mCherry XENC (LC-ETX-embryoidy) i BVSC ESC (BVSC-ETX-embryoidy) reporterowych linii komórkowych, odpowiednio. Aby wyizolować pojedyncze komórki, wybieramy tylko LC-ETX-embryoidy z tkankami podobnymi do DVE/AVE zidentyfikowanymi przez asymetrię ekspresji białek mCherry i wybieramy BVSC-ETX-embryoidy z asymetrią ekspresji białek mVenus w przedziale ESC w pobliżu granicy między przedziałami ESC i TSC. W przypadku LC-ETX-embryoidów pobierano 0, 24 i 84 h LC ujemne komórki wywodzące się z ESC (LC- XEN) oraz 84 h dodatnie ESC (BVSC+ ES) z przeciwnej strony LC- XEN. Dla BVSC-ETX-embryoidy, 0, 24, i 84 h BV negatywne ESC-pochodzące z komórek (BVSC- ES), jak również 84 h pozytywne ESC (BVSC+ ES) z przeciwnej strony BVSC- ES zostały zebrane. Ponadto pojedyncze komórki z przedziałów TSC w ETX-embryoidach złożonych z BVSC-ESCs w 0, 24 i 84 h zostały zebrane w oparciu o reporter EGFP.

Do separacji pojedynczych komórek wszystkie ETX-embryoidy inkubowano w 0,1% trypsynie-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, USA) przez 5 min w 37 ° C, a następnie przeniesiono do pożywki M2 (MR-015-D, Millipore). Po kilkukrotnym delikatnym pipetowaniu ustami, pojedyncze komórki izolowano za pomocą drobno wyciągniętej szklanej końcówki. Średnio dla każdego typu zbierano 30-40 komórek. Każdą komórkę przemywano trzykrotnie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, USA) zawierającej 0,1% BSA (Sigma-Aldrich, MO, USA) i umieszczano w mieszaninie wzorcowej do reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji-polimerazy (RT-PCR) w celu lizy, specyficznej dla sekwencji odwrotnej transkrypcji i wstępnej amplifikacji, jak opisano w poprzednim raporcie64.

Do projektowania i walidacji primerów, geny, które regulują różnicowanie linii komórkowej (głównie od E3.5 do E6.5 etapu) i uczestniczą w dominującym szlaku sygnalizacyjnym (np, Wnt, szlak sygnałowy Nodal), zostały wybrane zgodnie z embriogenezą myszy. Sekwencje mRNA dla każdego zainteresowanego genu zostały pobrane z NCBI, a dla genów o różnych transkryptach wykorzystano tylko wspólne regiony. Specyficzne dla genów primery qRT zostały zaprojektowane przy użyciu oprogramowania Primer3 w zakresie długości 100-250 bp. Wszystkie primery zostały przetestowane przy użyciu cDNA embrionów myszy (mieszanina E5.5 i E6.5) pod kątem wydajności amplifikacji i specyficzności (wymienione w Supplementary Data 1).

Single-cell sequence-specific pre-amplification similar to previous report65. Łącznie 96 zestawów primerów połączono do końcowego stężenia 0,1 μM dla każdego primera. Pojedyncze komórki wyizolowane z zarodków przenoszono do sterylnych mikropróbówek, do których w każdej probówce dodawano 5 μL mieszaniny wzorcowej RT-PCR zawierającej 2,5 μL mieszaniny reakcyjnej CellsDirect (Invitrogen, Carlsbad, USA), 0,5 μL puli primerów, 0,1 μL enzymu RT/Taq (Invitrogen, Carlsbad, USA) i 1,9 μL wody wolnej od nukleaz (Invitrogen, Carlsbad, USA). Probówki były natychmiast zamrażane w suchym lodzie. Po krótkim odwirowaniu w temp. 4 °C, probówki natychmiast umieszczano w maszynie do PCR. Lizę komórek i specyficzną dla sekwencji odwrotną transkrypcję przeprowadzono w temperaturze 50 °C przez 1 h. Następnie inaktywację odwrotnej transkryptazy i aktywację polimerazy Taq uzyskano przez ogrzewanie do 95 °C przez 3 min. Następnie, w tej samej probówce, cDNA poddano 20 cyklom specyficznej dla sekwencji amplifikacji poprzez denaturację w 95 °C przez 15 s oraz wyżarzanie i wydłużanie w 60 °C przez 15 min. Aby uniknąć odparowania, otrzymane produkty przechowywano w temperaturze -80 °C.

Dla wysokowydajnej mikroprzepływowej ilościowej PCR dla pojedynczych komórek, wszystkie wstępnie amplifikowane produkty cDNA były walidowane przez system real-time PCR (ABI 7500) przy użyciu endogennego genu kontrolnego Actinb, tylko wartość progowa przejścia (Ct) w granicach 9 do 12 była wybierana do kolejnych eksperymentów. Wzmocnione próbki jednokomórkowe analizowano przy użyciu SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX (Bio-Rad, Kalifornia, USA) i poszczególnych primerów qPCR w dynamicznych tablicach 96 × 96 na Biomark System (Fluidigm, San Francisco, USA). Obliczenia wartości Ct przeprowadzono za pomocą oprogramowania BioMark Real-Time PCR Analysis (Fluidigm, San Francisco, USA).

Dla przetwarzania i wizualizacji danych z pojedynczych komórek, wszystkie surowe wartości Ct uzyskane z systemu BioMark zostały przekonwertowane na względne poziomy ekspresji Log2 poprzez odjęcie wartości od założonej wartości Ct tła 26. Próbki z niską lub nieobecną ekspresją endogennych genów kontrolnych (Actinb i Gapdh) zostały wykluczone z dalszej analizy. PLS-DA zastosowano do danych ekspresji w celu dyskryminacji grup komórek w różnych zarodkach ETX za pomocą pakietu R mixOmics66. Hierarchiczne grupowanie przeprowadzono przy użyciu odległości euklidesowych, a dendrogramy wyświetlono wzdłuż skalowanych rzędowo map cieplnych przy użyciu pakietu fluidigmSC. Box-plots i violin plots wygenerowano za pomocą oprogramowania origin 8.6 i R.

Produkcja zarodków ESC-Chimerycznych BVSC

Produkowaliśmy zarodki ESC-Chimeryczne BVSC metodą wstrzykiwania zarodków 8-komórkowych za pomocą mikromanipulacji piezoelektrycznej67. Aby upewnić się, że zarodki gospodarza zostały wstrzyknięte przed zagęszczeniem, zebraliśmy zarodki w stadium dwukomórkowym i hodowaliśmy je in vitro. W celu uzyskania zarodków w stadium dwukomórkowym, 5-tygodniowe samice myszy poddawano superowulacji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pięciu jednostek międzynarodowych (IU) PMSG, a następnie 5 IU HCG 46-48 h później, po czym kojarzono je z samcami myszy. Zarodki w stadium dwukomórkowym pobierano przez przepłukanie jajowodu za pomocą M2 w E1,5. Zarodki płukano w M2 (MR-015-D, Millipore), a następnie przenoszono do 10 μL kropli KSOM (MR-020P-5F, Millipore) pokrytych olejem mineralnym na szalce do hodowli tkankowych. Zarodki utrzymywano w temperaturze 37°C przy 5% CO2 w inkubatorze.

Około 15 komórek ES wstrzykiwano do zarodków w stadium 8-komórkowym metodą mikromanipulacji Piezo67,68. Ośmiotygodniowe samice CD1 kojarzone z wazektomizowanymi samcami były wykorzystywane jako myszy pseudopłodne. Wstrzyknięte blastocysty były przenoszone do macicy pseudo-ciężarnych samic w 2,5 dniu post coitum (dpc). Zarodki w stadium moruli z wstrzykniętymi ESCs były przenoszone do jajowodów biorczyń w 0,5 dpc. Na każdą biorczynię transferowaliśmy 14-16 zarodków. W E6.5, zebraliśmy chimeryczne zarodki z deciduae, jak opisano powyżej.

Transfer zarodków i ocena implantacji

Ośmiotygodniowe samice CD1 kojarzone z wazektomizowanymi samcami były używane jako myszy pseudopłodne. Dla zrekonstruowanych zarodków, 36 h zrekonstruowane sfery (ETX-, ETS-, i EXE-embryoidy) zostały przeniesione do rogów macicy pseudopłodnych samic CD1 w 2,5 dpc lub 3,5 dpc. Na każdą biorczynię przenoszono od szesnastu do dwudziestu zarodków. Miejsca implantacji w dniu 6,5 zostały zidentyfikowane i policzone przez dożylne wstrzyknięcie 100 μL 1% roztworu błękitu chicagowskiego. Długość i promień każdego decdua mierzono za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, a objętość obliczano na podstawie tych pomiarów jako V = πr2l.

Barwienie hemoglobiny i barwienie immunologiczne miejsc implantacji

Aby zbadać potencjał rozwojowy samodzielnie zmontowanych zarodków, zebraliśmy decidua z różnych etapów, w tym 48, 72 i 84 h po transplantacji. Te zrekonstruowane (ETX, EXE i ETS) próbki zarodków zostały utrwalone 4% paraformaldehydem na noc w 4 °C, odwodnione gradientem alkoholi, przeniesione do ksylenu i osadzone w parafinie. Jako kontrolę użyto zarodków typu dzikiego E5.5, E6.0 i E6.5. Próbki były cięte na plastry o grubości 5 μm, barwione hematoksyliną i eozyną, a następnie obserwowane pod mikroskopem. Odparafinowane, uwodnione próbki poddawano termicznej obróbce epitopowej w buforze cytrynianowym w temperaturze około 95°C w kuchence mikrofalowej przez 10 minut, a następnie schładzano do temperatury pokojowej i dwukrotnie płukano w PBS przez 3 minuty. Permeabilizację przeprowadzono za pomocą 0,5% Triton X-100 w PBS przez 20 min w temperaturze pokojowej. Po permeabilizacji próbki płukano w PBS trzykrotnie (po 3 min.). Następnie próbki blokowano przez 30 min z 5% surowiczą albuminą bydlęcą (BSA) w PBS i inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi przeciwko króliczemu anty-CK (ab9377, Abcam), króliczemu anty-COX2 (ab15191, Abcam), króliczemu anty-Laminin (L9393, Sigma), koziemu anty-Gata4 (sc-1237, Santa Cruz) lub mysiemu anty-PL1 (sc-376436, Santa Cruz) w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia plastry płukano trzykrotnie w PBS przez 5 min i inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 min w temperaturze 37 °C. Przeciwciała drugorzędowe były znakowane Alexa Fluorophore 488 lub 594 (Invitrogen). Następnie sekcje były płukane sześciokrotnie w PBS przez 5 minut każda i utrwalane medium montażowym Fluoroshield z DAPI (ab104140, Abcam). Szkiełka przechowywano w temperaturze -20 °C do czasu obserwacji. Obrazy rejestrowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Leica.

Hybrydyzacja in situ

Hybrydyzację in situ z digoksygeniną (DIG) przeprowadzono na kriosekcjach52. Do hybrydyzacji użyto mysio-specyficznych sond cRNA dla Dtprp. Sekcje hybrydyzowane z sondami sensownymi służyły jako kontrola negatywna. Zamrożone wycinki (8-10 μm) przyklejano na szkiełka pokryte poli-l-lizyną (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, Chiny) i przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Sekcje umieszczano w podgrzewaczu szkiełek (37 °C) na 2 min, a następnie rehydratowano w PBS, utrwalano w 4% PFA przez 15 min w 4 °C, traktowano proteinazą K (15 μg na mL przez 5 min w temperaturze pokojowej), 0,25% acetylowano przez 10 min i hybrydyzowano z sondami znakowanymi DIG przez noc w 65 °C. Przeprowadzono dwa płukania pohybrydyzacyjne w 65 °C, a następnie dwa płukania w 1 × MABT i 30-minutowe traktowanie RNazą (20 μg na mL) w 37 °C. Sekcje blokowano przez 1 h, a następnie inkubowano przez noc w bloku z przeciwciałem anty-DIG (1:2500, Sigma-Aldrich). Po płukaniu, kolor był wywoływany przy użyciu NBT/BCIP, aż do uwidocznienia brązowego osadu. Diapozytywy były barwione czerwienią szybką jądrową, odwodnione i oczyszczone w ksylenie, a następnie utrwalone w medium montażowym cytoseal. Fotografie wykonywano tuż przed zanikiem osadu INT/BCIP.

Identyfikacja genotypowa przeniesionych zarodków samoprzylepnych

Genomowe DNA ekstrahowano z DsRed-ESCs, EGFP-TSCs i ETX-embryoidów wyizolowanych z tkanek decidua przy użyciu TIANamp Micro DNA Kit (DP316, Tiangen) zgodnie z instrukcjami producenta. Zestaw starterów diagnostycznych EGFP (5ʹ-AGGACGTCATCAAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATAGTCTTCTTCTG-3ʹ) i DsRed (5ʹ-GTGCTTCAGCCGCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCACCTTGATGCCGTTCT-3ʹ) wykorzystano do identyfikacji regionu komórek i próbek metodą PCR. Profil termiczny wynosił 95 °C przez 5 min, 35 cykli 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 20 lub 40 s, a końcowy cykl w 72 °C przez 5 min.

Statystyki

Analizy statystyczne zostały przetworzone na oprogramowaniu GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA) dla Windows (w tym jednokomórkowe dane log2 ekspresji). Dane zostały sprawdzone pod kątem rozkładu normalnego i równych wariancji za pomocą testu F przed wykonaniem każdego parametrycznego testu statystycznego. Tam, gdzie było to właściwe, wykonano dwuwarstwowe testy t-Studenta z poprawką Welcha, jeśli wariancja między grupami nie była równa. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy s.e.m lub s.d., jak określono. Legendy rycin wskazują liczbę niezależnych eksperymentów wykonanych w każdej analizie. Każdy eksperyment został powtórzony dla odtwarzalności.

Objętość tkanki (Fig. 1i i 7c, i Uzupełniające Fig. 4h), obliczenie procentowe i liczbowe (Fig. 2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m i 7n; Uzupełniające Fig. 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a i 12g) określono za pomocą programu Excel. Analizę istotności przeprowadzono za pomocą testu t-test w programie GraphPad Prism. Wykresy słupkowe sporządzono za pomocą Excela i GraphPad Prism, a wykresy rozrzutu wykreślono za pomocą GraphPad Prism.

Podsumowanie

Dalsze informacje na temat projektu eksperymentalnego są dostępne w Nature Research Reporting Summary powiązanym z tym artykułem.

.