În acest studiu, am investigat asocierea dintre SNP-urile 3′UTR ale genelor implicate în transportul medicamentelor FAC, metabolismul, reglarea căilor de detoxifiere, receptorii nucleari, parametrii clinici și răspunsul global la chimioterapia FAC. Rezultatele sugerează că riscul de deces, de progresie a bolii sau de recidivă a cancerului de sân este modificat de variantele genetice ale receptorilor nucleari (NR1/2, PGR), ale genelor implicate în principala cale metabolică a doxorubicinei (SLC22A16) și ale genei legate de doxorubicină-progesteron (AKR1C3). SNP-urile din cadrul genelor DPYD și ALDH5A1 au fost asociate în mod semnificativ cu creșterea riscului de creștere a analizelor RFS și a răspunsului la tratament/TFFS. Factorii de prognostic clinic care au influențat supraviețuirea și răspunsul la tratament în studiul nostru s-au grupat în trei categorii – componentele stadializării TNM în OS și PFS, statusul receptorilor tumorali de progesteron în RFS și răspuns/TFFS și implementarea procedurilor chirurgicale (indiferent de amploarea lor) în analizele răspunsului la tratament/TFFS.

Familia PXR joacă o funcție de reglare în raport cu enzimele de fază I (enzimele citocrom P450 CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9 și CYP2C19), enzimele de fază II (UGT1A1, UGT1A2, SULT2A) și transportatorii de fază III (ABCB1, OATs, MRP3)37,38,39,40,41,42. 3′UTR al receptorului de pregnan X (NR1/2/PXR2), o componentă cheie a senzorului de xenobiotice, sunt ținte pentru prezența mai multor microARN-uri, inclusiv miR-362-5p, miR-500b-5p și miR-501-5p, ceea ce sugerează importanța reglementării epigenetice a expresiei NR1/221. Observațiile noastre privind corelațiile dintre varianta genetică 3′UTR a genei menționate și supraviețuirea pacienților par să susțină o astfel de afirmație, însă legătura genetică-clinică exactă nu a fost încă confirmată. Reuter și colegii săi au căutat o astfel de corelație și, deși au arătat un impact al polimorfismelor NR1/2 asupra expresiei proteice în probele de sânge și țesut ale pacienților cu carcinom cu celule scuamoase la nivelul capului și gâtului (HNSCC), nu au reușit să demonstreze influența acestora asupra duratei totale de supraviețuire43.

Indiferent de inconsecvența rezultatelor cercetărilor, este plauzibil faptul că variațiile genetice din cadrul NR1/2 care influențează expresia sau activitatea proteică, au efecte clinice semnificative cu caracter divers38. SNP-urile din cadrul secvenței codificatoare a genei NR1/2 au fost corelate cu riscul de cancer global44, progresia SIDA45, au fost potențialul factor de risc al rezistenței la medicamente în epilepsie46, precum și al toxicității hematologice induse de irinotecan la pacienții cu cancer colorectal47. Variantele genetice din regiunea 3′UTR a NR1/2 afectează transportul, localizarea și stabilitatea ARNm NR1/214,40. Mai multe studii au confirmat influența SNP-urilor 3′UTR ale NR1/2 asupra efectelor tratamentului, cu o creștere rezultată a rezistenței la chimioterapie, de asemenea, la pacienții cu cancer de sân39,40,40,41,42. Grupul lui Oleson a asociat rs3732359 și rs3732360 din NR1/2 cu o activitate CYP3A mai mare in vivo. CYP3A4 este principala enzimă metabolizatoare de medicamente și gena efectoare din aval a NR1/2. Mai mult, Oleson et al. au constatat că variantele rs373232359 și rs3732360 ale NR1/2 au prezentat un clearance median mai mare al midazolamului oral în comparație cu genotipurile de referință homozigote pentru aceste SNP38. În grupul nostru de pacienți, prezența rs373232359 AA NR1/2 a fost un predictor independent al OS. În analizele univariate, purtătorii cu genotipul AA prezintă o creștere de aproape 2 ori a riscului de deces în comparație cu pacienții NR1/2 rs3732359 AG/GG. Această observație a sugerat asocierea rs3732359 AA NR1/2 cu un prognostic mai prost de supraviețuire la femeile cu cancer de sân tratate cu chimioterapie FAC. Observații similare cu ale noastre au fost raportate în studiul lui Swart et al. unde rs3732359 alela A NR1/2 a diferențiat pacienții în subgrupuri în funcție de disproporția medicamentelor și de răspunsul la terapie21. Acest rezultat a fost în concordanță cu observațiile lui Chew et al. conform cărora rs3732359 NR1/2 a fost asociat cu o reducere semnificativă a hemoglobinei nadir, a trombocitelor și/sau a numărului absolut de neutrofile (ANC) față de valoarea inițială în ciclul 1, fie dependentă, fie independentă de efectele asupra farmacocineticii docetaxelului la pacienții cu cancer nazofaringian48. Aceste rezultate sugerează efectul rs3732359 asupra capacității hematopoietice a măduvei osoase și a capacității de a angaja mecanisme de detoxifiere în prezența xenobioticelor.

În studiul nostru a existat o asociere clară a polimorfismelor din cadrul genei SLC22A16 angajate în transportul doxorubicinei cu riscul de deces și de progresie a bolii. Ota et al. și Faraji et al. au împins că polimorfismele din cadrul SLC22A16 au afectat farmacodinamica sistemică a chimioterapiei pe bază de doxorubicină49,50. În studiul nostru, purtătorii rs7756222 CC și rs9487402 TG/GG SLC22A16 au scăzut OS. Mai mult, varianta rs7756222 CC SLC22A16 a fost factorul independent care scurtează PFS. Rezultatele noastre sunt în concordanță cu rezultatele lui Lal et al. 2007, conform cărora SNP-urile din SLC22A16 sunt asociate cu OS și PFS mai scurte la pacientele asiatice cu cancer de sân51. În plus, studii anterioare au confirmat asocierea SNP-urilor din SLC22A16 cu efectele secundare toxice ale chimioterapiei la pacientele cu cancer de sân36,50,52. În plus, supraexpresia SLC22A16 în celulele canceroase este asociată cu creșterea influxului de doxorubicină în celulă și este corelată cu o sensibilitate crescută la efectele citotoxice ale acestui medicament53. În cazul pacienților cu cancer gastric, suprareglarea SLC22A16 a prezis, în mod independent, o prognosticare slabă a OS și RFS în cazul cancerului gastric precoce și o OS slabă în cazul cancerului gastric avansat54. Kunii et al. au demonstrat, de asemenea, că SLC22A16 este un mediator al absorbției platinei în celulele canceroase, iar reglarea negativă a SLC22A16 este posibil să fie unul dintre mecanismele de rezistență la cisplatin în cancerul pulmonar55. Rapoartele citate confirmă faptul că variantele genetice din cadrul genei SLC22A16 influențează eficacitatea importului medicamentelor chimioterapeutice în celulă, în timp ce toxicitatea generată de nivelul modificat al medicamentului în celulă s-a coroborat cu cel mai prost răspuns la tratament.

Prezentăm doi factori genetici de prognostic independenți care au influențat semnificativ riscul de scurtare a PFS (rs1824125 GG și CC rs11224560 din PGR) și RFS (rs3209896 AG AKR1C3) la pacientele cu cancer de sân. Din cunoștințele noastre, acesta este primul raport privind interacțiunile potențiale atât ale rs1824125 GG și rs11224560 CC ale receptorului de progesteron, cât și ale rs3209896 AG AKR1C3 (gena legată de progesteron) cu supraviețuirea și răspunsul la tratament. Din nefericire, lipsesc datele funcționale pentru rs1824125 și rs11224560 din PGR, dar poziția variantelor studiate în secvențele de reglementare a genei indică la rolul lor suspectat în controlul expresiei. Este îndeobște cunoscut faptul că expresia controlată a receptorului de progesteron este crucială pentru dezvoltarea țesutului mamar, cu atât mai mult cu cât gena PGR are doi promotori și situsuri de start translațional și produce două izoforme, PR-A și PR-B. PR-B este regulatorul pozitiv al efectelor progesteronului, dar PR-A antagonizează efectele PR-B56. Expresia echilibrată a ambelor izoforme PR este necesară pentru menținerea funcției glandei mamare, iar orice dezechilibru este asociat cu riscul crescut de cancer mamar. În acest sens, s-a demonstrat că alterarea echilibrului PR-A și PR-B distorsionează efectele progesteronului asupra celulelor mamare, crescând astfel riscul de cancer mamar57.

În acest studiu am prezentat posibila relație dintre riscul de recidivă locală și varianta rs3209896 AG în AKR1C3. AKR1C3 este o enzimă metabolizatoare a medicamentelor de fază I implicată în rezistența la chimioterapice, inclusiv la doxorubicină58. Aceasta joacă un rol semnificativ în dezactivarea doxorubicinei în doxorubicinol, un metabolit mai puțin activ59. Polimorfismele în AKR1C3 au fost studiate ca factori de risc pentru cancerul pulmonar, de prostată60, limfom61 și vezică urinară62. Există, de asemenea, rapoarte privind rolul variației AKR1C3 în riscul de progresie a bolii și mortalitate în limfomul non-Hodgkin cu celule B63, precum și în modularea toxicității tratamentului și a duratei de supraviețuire la pacientele cu cancer de sân58. Cu toate acestea, influența polimorfismului rs3209896 asupra riscului de cancer și a răspunsului la chimioterapie a fost luată în considerare doar în două studii anterioare, dar fără succes. În primul, pacientele asiatice cu cancer de sân tratate cu chimioterapie care conține doxorubicină nu au arătat nicio corelație între rs3209896 AG AKR1C3 cu chimiotoxicitatea, PFS și OS58. În cel de-al doilea studiu, analizele genetice materne și ale descendenților genei AKR1C3 nu au evidențiat asocierea rs3209896 AKR1C3 în legătură cu riscul de leucemie infantilă61. În studiul nostru, legătura genetică-clinică în ceea ce privește rezultatul la pacientele cu cancer de sân tratate cu regim FAC care conține doxorubicină, pe de altă parte, a existat. Un studiu anterior a sugerat că AKR1C3 aparține familiei de gene legate de progesteron implicate în metabolismul prereceptor al progesteronului și a considerat că este un activator mai slab al PGR64. Având în vedere aceste date, rezultatele noastre subliniază și mai mult importanța clinică a căilor de semnalizare a progesteronului. Studiul realizat de Reding et al. a arătat că variația în genele AKR1C2 și AKR1C3 ar putea crește riscul de cancer de sân în rândul femeilor care au utilizat terapia estrogen-progesteron65. Un rol putativ în cancerul mamar bazat pe enzimele AKR1C care metabolizează progesteronul în 4-pregnenă a fost descris de Ji et al. Acești autori au speculat că pierderea AKR1C1 și AKR1C2, dar nu și a AKR1C3 în cancerul de sân, a dus la o scădere a catabolismului progesteronului care, în combinație cu o expresie crescută a PR, poate crește semnalizarea progesteronului prin receptorii săi nucleari64.

În studiul nostru, purtătorii rs291593 CC DPYD au avut un risc mai mare de recidivă a bolii. DPYD catabolizează 5-fluorouracilul (5-FU), care este utilizat în mod obișnuit pentru tratamentul carcinoamelor solide66,67,68 și este, de asemenea, componenta regimului FAC. O scădere a activității enzimatice poate duce la o creștere a timpului de înjumătățire a 5-FU și la un risc crescut de toxicitate dependentă de doză67,68,68,69,70. SNP rs291593 CC DPYD a fost descris în studiul lui Kim et al. care s-a axat pe distribuția alelei la 150 de subiecți coreeni68. Din păcate, nu există date din literatura de specialitate cu privire la efectul rs291593 DPYD și corelația cu supraviețuirea și răspunsul la tratament.

În ultimul rând, în grupul nostru de pacienți analizat, polimorfismul rs1054899 AG/AA ALDH5A1 s-a corelat cu un răspuns mai prost la chimioterapia FAC. ALDH5A1 este o componentă a căii metabolice a ciclofosfamidei. Un deficit al acestei enzime este o tulburare neurologică autosomal recesivă rară, în care un defect enzimatic grav legat de o mutație genetică în calea de degradare a GABA determină o creștere consecutivă atât a GABA, cât și a acidului gama-hidroxibutiric (GHB)71,72,73,74,74,75. În afară de căile neurotransmițătoare, ALDH5A1, alături de ALDH1A1 și 3A1, participă la transformarea ciclofosfamidei, ghidând detoxifierea aldofosfamidei în carboxifosfamidă inactivă76. Este larg acceptat faptul că diferențele interindividuale în formarea metaboliților ciclofosfamidei pot rezulta din polimorfisme în genele care catalizează reacțiile metabolice, precum și din modificări ale expresiei acestora77. Deși lipsesc datele cu privire la impactul exact al variației reglatoare 3′UTR a ALDH5A1 asupra activității ciclofosfamidei, există rapoarte care sugerează legătura dintre expresia enzimei și prognosticul tratamentului. Grupul lui Tian a raportat că expresia scăzută a ALDH5A1 este un factor predictiv excelent de prognostic nefavorabil în cancerul ovarian (OC) și poate juca un rol crucial în progresia cancerului ovarian. Asocierea pozitivă între expresia ALDH5A1 și prognosticul a fost găsită în stadiile timpurii și avansate ale pacientelor cu cancer ovarian. În gradele II/III de cancer ovarian, un nivel ridicat de ARNm al ALDH5A1 a fost asociat cu o îmbunătățire a OS78. Studiile efectuate pe pacienți chinezi cu epilepsie au confirmat, că rs1054899 al genei ALDH5A1 poate juca un rol în farmacocinetica acidului valproic (VPA) cu proprietăți anticonvulsivante79.

În analizele noastre, OS și PFS scurtate și riscul ridicat de deces și progresie au fost rezultatele bolii avansate – dimensiunea tumorii de peste 20 mm în cea mai mare dimensiune (adică componenta T mai mare decât T1), ganglionii limfatici regionali infiltrați (adică componenta N diferită de N0) și prezența de metastaze la distanță (M1). Aceste observații sunt în concordanță cu percepția tradițională a progresiei în trepte a cancerelor mamare, de la tumori mici, care nu s-au răspândit încă, la cele mai mari și mai agresive80. Dimensiunea tumorii (componenta T) este văzută ca fiind unul dintre cei mai importanți factori de răspuns la tratament. În studiul lui Goorts et al.81 , dimensiunea clinică a tumorii (cT) a fost cel mai puternic factor predictiv al obținerii răspunsului patologic complet (pCR), văzut ca absența cancerului rezidual, în grupul de paciente cu cancer de sân după chimioterapie neoadjuvantă. În acest studiu, stadiile cT mai mari au avut rate pCR puternic și semnificativ mai mici, independent de grad și de progesteron, de receptorii de estrogen și de statutul HER2. De asemenea, cea mai nouă ediție, a opta, a Manualului de stadializare a cancerului82 confirmă faptul că întregul sistem de stadializare TNM pentru cancerul de sân este estimarea volumului total al tumorii, descris de dimensiunea maximă a masei tumorale, fără includerea focarelor satelit mici suplimentare care înconjoară tumora principală83.

Prezența metastazelor ganglionare regionale este un alt factor recunoscut de prognostic mai prost la pacientele cu cancer de sân. Conform celor mai noi ghiduri, clasificarea ganglionilor se face în funcție de mărimea celui mai mare depozit tumoral, iar suma ganglionilor limfatici infiltrați rezultă în valoarea N finală82. În general, amploarea afectării ganglionilor se reflectă în înrăutățirea prognosticului pacientelor, observată – printre altele – în reducerea duratei de supraviețuire84. În mod similar, prezența, localizarea și extinderea metastazelor la distanță sunt fără echivoc responsabile de un prognostic nefavorabil, estimându-se că 90% din decesele legate de cancerul mamar se datorează diseminării metastatice85. O astfel de corelație drastică a fost observată și în analizele noastre, unde prezența metastazelor la distanță a fost cel mai puternic factor de reducere a supraviețuirii, de asemenea, din punct de vedere statistic. Această situație pare să reflecte discordanțele dintre tumorile primare și cele secundare, în ceea ce privește caracteristicile clinice și biologice care modifică rata de răspuns la tratament între aceste situsuri. De asemenea, există modele complicate care leagă răspândirea metastatică de localizarea masei primare, de vârsta pacienților și, de asemenea, de impactul neprevăzut al procedurilor chirurgicale asupra masei tumorale principale, ceea ce poate spori creșterea micrometastazelor latente în diferite organe85.

În studiul nostru, statutul negativ al receptorilor de progesteron în cancerul de sân a fost determinant pentru riscul ridicat de recidivă, TFFS mai scurt și lipsa de răspuns la tratament. Statutul PR, al receptorilor de estrogen (ER) se numără printre factorii biologici, în afară de expresia HER2 și de grad, care fuseseră încorporați în sistemul de stadializare a cancerului de sân. Scopul unei astfel de abordări a fost acela de a combina cele mai recente cunoștințe biologice cu cercetarea clinică actualizată în speranța de a stabili ghidul de stadializare simplu, dar precis, care să definească prognosticul cu cea mai mare precizie posibilă86. Lipsa de expresie a receptorilor de progesteron în cancerul de sân a fost în ultimii ani raportată în mod repetat ca factor de rezultat slab al tratamentului, ceea ce este în concordanță cu rezultatele noastre. În lucrarea lui Purdie și a altora, grupul de paciente PR-negative, chiar și subgrupurile care altfel ar avea un prognostic bun – adică ER-pozitive și fără infiltrare ganglionară, au avut o supraviețuire specifică cancerului de sân la 5 ani semnificativ mai scurtă, cu sau fără aplicarea chimioterapiei87. În lucrarea citată, expresia PR a fost factorul prognostic independent, mai puternic decât statusul ER. Rezultate similare au reieșit din studiul lui van Mackelenbergh et al. în care cancerele mamare cu ER pozitiv/PR negativ au prezentat un răspuns inițial mai bun la tratament, chiar dacă, în cele din urmă, supraviețuirea pe termen lung după chimioterapia neoadjuvantă fusese semnificativ redusă88. Complexitatea impactului statutului receptorilor hormonali asupra rezultatelor tratamentului ar putea rezulta din mecanismele de interacțiune încrucișată existente între receptorii de estrogen și progesteron. Atunci când PR este absent, receptorul de estrogen recrutează cofactori specifici și se leagă de elementele de răspuns estrogenic din cromatină. Rezultatul este activarea unor căi care conduc la proliferarea celulară89. O astfel de interacțiune încrucișată a fost ilustrată în lucrarea lui Mohammed și colab.90, care au subliniat, că în cancerul mamar PR modulează comportamentul ER, iar expresia sa poate fi văzută ca un marker al funcției ER.

Analizele factorilor genetici și clinici ar putea fi utile în încercarea de a stabili modele complexe combinate genetic-clinice pentru preselecția pacientelor în grupuri mai uniforme cu prognostic similar în ceea ce privește decesul, progresia bolii, recidiva, dezvoltarea cancerului mamar metacronic și răspunsul global la tratament. Pentru a face acest lucru, am efectuat analize cumulative și am selectat grupurile de pacienți cu cel mai prost prognostic aparent, care purtau cel mai mare număr de factori nefavorabili într-un anumit context. Pentru fiecare dintre analize, componenta clinică a evidențiat avansarea bolii. Tabloul a fost completat în continuare prin adăugarea modificatorilor genetici. Din cauza lipsei frecvente de date cu privire la impactul exact al variantei genetice studiate asupra funcției genetice sau proteice, fiecare interpretare a modelului cumulativ trebuie făcută cu mare precauție. Cu toate acestea, OS și cel mai mare risc de deces a fost rezultatul evident al stadiilor TNM avansate, dar prezența a două variante în transportatorul de doxorubicină SLC22A16 în acest model subliniază importanța afluxului optim de medicament în celule. În plus, activitatea principalului comutator de detoxifiere NR1/2 în modelul OS pare a fi actorul care mediază riscul de deces. Am putea presupune că răspunsul mai slab la tratament în această privință ar putea fi reflectarea rutelor de detoxifiere hiperactive ale oricăruia dintre medicamentele FAC, ceea ce scade concentrația terapeutică a medicamentelor. Trebuie remarcat faptul că forța acestui model este întărită și mai mult de lipsa incidențelor de deces în grupul celor care nu sunt purtători ai factorilor de risc ridicat.

Grupul cu cel mai prost prognostic în ceea ce privește evoluția cancerului a fost, de asemenea, caracterizat de avansarea bolii (metastaze) și de varianta polimorfică în gena importatoare de doxorubicină SLC22A16. Cu toate acestea, în acest model, tabloul a fost completat de prezența a două SNP-uri în gena receptorului de progesteron. „Dublul succes” ca atare, la fel ca și în cazul SLC22A16 în analiza OS, evidențiază relațiile dintre căile fiziologice, metabolice și de semnalizare ale progesteronului și capacitatea metastatică a celulelor canceroase mamare, precum și revigorarea micrometastazelor latente. Căile de semnalizare a progesteronului, văzute ca statut negativ al receptorului PR în celulele canceroase, au apărut, de asemenea, ca fiind componenta celui mai rău scenariu în analiza supraviețuirii fără recidivă. În această situație însă, riscul ridicat de recidivă a fost concomitent dependent de modificarea în catabolizatorul 5-fluorouracilului DPYD, precum și în AKR1C3, componenta atât a mecanismelor metabolice ale doxorubicinei, cât și a progesteronului. Acest rezultat subliniază încă o dată importanța semnalizării progesteronului și a activității mașinăriei de detoxifiere, care asigură concentrația optimă a medicamentelor terapeutice.

Din câte știm noi, acesta este primul studiu care evaluează valoarea prognostică a polimorfismelor 3′UTR ale genelor ADME în contextul răspunsului global la tratament în cancerul de sân. Cu toate acestea, determinanții clinici ca factori de risc ridicat au dominat pe cei genetici în această analiză. În mod nesurprinzător, rezultatele au arătat că statutul negativ al tumorii PR, împreună cu lipsa procedurilor chirurgicale, care, la rândul său, este consecința directă a stării precare a pacientei, sunt factorii de predicție a evenimentelor negative, cum ar fi decesul, progresia, recidiva și dezvoltarea unui alt cancer de sân. Singura componentă genetică din acest model, varianta în ALDH5A1, evidențiază mecanismele catabolice ale ciclofosfamidei. În plus, puterea acestui model este susținută de rezultatele analizei TFFS. În timp ce răspunsul inițial la tratament în această lucrare a fost estimat în termen de 10 luni de la începerea chimioterapiei, separarea obținută a pacienților în grupuri în ceea ce privește numărul de factori nefavorabili a permis prezicerea supraviețuirii pe termen lung. În urma acestei analize, raportăm reducerea fără precedent, de peste 14 ori, a medianei de supraviețuire între grupurile cu cel mai bun și cel mai prost prognostic.

În concluzie, variantele germinale normale prezente în mod obișnuit în populație sunt factori importanți care determină răspunsul la tratament. Studiul arată că polimorfismele sunt un factor predictiv independent de prognostic al supraviețuirii la femeia cu cancer de sân. Mai mult, am observat efectul acumulării mai multor factori genetici și clinici nefavorabili asupra prognosticului slab de supraviețuire și a răspunsului global la tratament. Rezultatele sugerează că polimorfismele din linia germinală influențează farmacocinetica doxorubicinei. Studiul nostru indică cele mai puternice asocieri între supraviețuirea globală, supraviețuirea fără progresie și polimorfismele genetice în gena SLC22A16 angajată în transportul doxorubicinei. În plus, SNP în AKR1C3, o genă implicată în calea metabolismului doxorubicinei, are un efect asupra supraviețuirii fără recidivă. În concluzie, prezența factorilor genetici și clinici nefavorabili crește riscul de rezultate slabe ale răspunsului la tratament la femeile poloneze cu cancer de sân care au fost tratate cu regim FAC. Acest studiu implică faptul că selecția pacienților pe baza modelelor cumulative de factori nefavorabili poate fi utilă în predicția prognosticului în ceea ce privește decesul, progresia sau recidiva.

.