I denna studie, undersökte vi sambandet mellan 3′UTR SNPs av gener som är involverade i FAC-läkemedels transport, metabolism, reglering av avgiftningsvägar, kärnreceptorer, kliniska parametrar och det totala svaret på FAC-kemoterapi. Resultaten tyder på att risken för död, sjukdomsprogression eller återfall av bröstcancer modifieras av genetiska varianter av kärnreceptorer (NR1/2, PGR), gener som är engagerade i den huvudsakliga metaboliska vägen för doxorubicin (SLC22A16) och doxorubicin-progesteron-relaterad gen (AKR1C3). SNPs inom DPYD- och ALDH5A1-gener var signifikant förknippade med ökad risk för RFS- och behandlingssvar/TFFS-analyser. De kliniska prognostiska faktorerna som påverkade överlevnad och behandlingssvar i vår studie har grupperat sig i tre kategorier – komponenterna i TNM-stadieindelningen i OS och PFS, tumörprogesteronreceptorstatus i RFS och respons/TFFS och genomförandet av kirurgiska ingrepp (oavsett omfattning) i behandlingssvar/TFFS-analyser.

PXR-familjen har en reglerande funktion med hänvisning till enzymer i fas I (cytokrom P450-enzymerna CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9 och CYP2C19), enzymer i fas II (UGT1A1, UGT1A2, SULT2A) och fas III-transportörer (ABCB1, OATs, MRP3)37,38,39,40,41,42. 3′UTR av pregnan X-receptorn (NR1/2/PXR2), en nyckelkomponent i xenobiotikasensorn, är måltavlor för närvaron av flera mikroRNA, inklusive miR-362-5p, miR-500b-5p och miR-501-5p, vilket tyder på betydelsen av epigenetisk reglering av NR1/2-uttrycket21. Våra observationer av sambanden mellan den nämnda genens 3′UTR-genvariant och patienternas överlevnad tycks stödja ett sådant påstående, men den exakta genetiskt-kliniska kopplingen har ännu inte bekräftats. Reuter och medarbetare sökte efter en sådan korrelation, och även om de visade en inverkan av NR1/2-polymorfismer på proteinuttryck i blod- och vävnadsprover från patienter med skivepitelcancer i huvud och hals (HNSCC), kunde de inte påvisa deras påverkan på den totala överlevnadstiden43.

Oavsett inkonsekvenserna i forskningsresultaten är det rimligt att genetiska variationer inom NR1/2, som påverkar proteinuttryck eller -aktivitet, har betydande kliniska effekter av olika karaktär38. SNP inom den kodande sekvensen av NR1/2-genen har korrelerat med risken för total cancer44, utveckling av aids45, var en potentiell riskfaktor för läkemedelsresistens vid epilepsi46 samt för hematologisk toxicitet inducerad av irinotekan hos patienter med kolorektalcancer47. Genetiska varianter i NR1/2:s 3′UTR-region påverkar transport, lokalisering och stabilitet av NR1/2 mRNA14,40. Flera studier har bekräftat att 3′UTR SNPs av NR1/2 påverkar behandlingseffekterna med en resulterande ökning av resistensen mot kemoterapi även hos bröstcancerpatienter39,40,41,42. Olesons grupp associerade rs3732359 och rs3732360 av NR1/2 med högre CYP3A-aktivitet in vivo. CYP3A4 är det viktigaste läkemedelsmetaboliserande enzymet och nedströms effektorgen för NR1/2. Vidare fann Oleson et al. att varianter rs3732359 och rs3732360 av NR1/2 uppvisade högre mediantisk oral midazolamclearance jämfört med homozygota referensgenotyper för dessa SNPs38. I vår patientgrupp var förekomsten av rs3732359 AA NR1/2 en oberoende prediktor för OS. I univariata analyser uppvisar bärare med genotyp AA en nästan 2-faldig ökning av dödsrisken jämfört med patienter NR1/2 rs3732359 AG/GG. Denna observation tyder på ett samband mellan rs3732359 AA NR1/2 och sämre överlevnadsprognos hos kvinnor med bröstcancer som behandlas med FAC-kemoterapi. Observationer som liknar våra rapporterades i studien av Swart et al. där rs3732359 allel A NR1/2 differentierade patienterna i undergrupper enligt läkemedelsdisproportion och terapisvar21. Detta resultat överensstämde med Chew et al:s observationer att rs3732359 NR1/2 var förknippad med en signifikant minskning av nadirhemoglobin, trombocyter och/eller absolut neutrofilantal (ANC) från baslinjen i cykel 1, antingen beroende eller oberoende av effekterna på docetaxels farmakokinetik hos patienter med nasofarynxcancer48. Dessa resultat tyder på effekten av rs3732359 på benmärgens hematopoietiska kapacitet och förmågan att engagera avgiftningsmekanismer i närvaro av xenobiotika.

I vår studie fanns det ett tydligt samband mellan polymorfismer inom SLC22A16-genen som är engagerad i doxorubicintransporten och risken för död och sjukdomsprogression. Ota et al. och Faraji et al. sköt att polymorfismer inom SLC22A16 påverkade den systemiska farmakodynamiken av doxorubicinbaserad kemoterapi49,50. I vår studie har bärare rs7756222 CC och rs9487402 TG/GG SLC22A16 minskat OS. Dessutom var variant rs7756222 CC SLC22A16 den oberoende faktorn som förkortade PFS. Våra resultat överensstämmer med resultaten från Lal et al. 2007, att SNPs i SLC22A16 är associerade med kortare OS och PFS hos asiatiska bröstcancerpatienter51. Dessutom har tidigare studier bekräftat att SNPs inom SLC22A16 är associerade med toxiska biverkningar vid kemoterapi hos bröstcancerpatienter36,50,52. Dessutom är överuttryck av SLC22A16 i cancerceller förknippat med ökat inflöde av doxorubicin i cellen och korrelerar med ökad känslighet för cytotoxiska effekter av detta läkemedel53. Hos patienter med magsäckscancer förutspådde uppreglering av SLC22A16 oberoende av varandra dålig OS och RFS i tidig magsäckscancer och dålig OS i avancerad magsäckscancer54. Kunii et al. visade också att SLC22A16 är en mediator för upptag av platina i cancerceller, och nedreglering av SLC22A16 är möjligen en av mekanismerna för resistens mot cisplatin i lungcancer55. De citerade rapporterna bekräftar att de genetiska varianterna inom SLC22A16-genen påverkar kemoterapeutiska läkemedels import effektivitet i cellen, medan toxicitet som genereras av den förändrade läkemedelsnivån i cellen korrogerade med det sämsta behandlingssvaret.

Vi presenterar två oberoende genetiska prognostiska faktorer som signifikant påverkade risken för förkortad PFS (rs1824125 GG och CC rs11224560 i PGR) och RFS (rs3209896 AG AKR1C3) i bröstcancerpatienter. Såvitt vi vet är detta den första rapporten om potentiella interaktioner mellan både rs1824125 GG och rs11224560 CC progesteronreceptor samt rs3209896 AG AKR1C3 (progesteronrelaterad gen) med överlevnad och behandlingssvar. Tyvärr saknas funktionella data för PGR:s rs1824125 och rs11224560, men de studerade varianternas placering i genens reglerande sekvenser pekar på deras misstänkta roll i uttryckskontrollen. Det är allmänt känt att det kontrollerade uttrycket av progesteronreceptorn är avgörande för utvecklingen av bröstvävnad, särskilt som PGR-genen har två promotorer och startplatser för translation och producerar två isoformer, PR-A och PR-B. PR-B är den positiva regulatorn av progesterons effekter, medan PR-A motverkar PR-B:s effekter56. Ett balanserat uttryck av båda PR-isoformerna krävs för att upprätthålla bröstkörtelfunktionen, och varje obalans är förknippad med ökad risk för bröstcancer. I detta avseende har det visats att förändrad PR-A- och PR-B-balans snedvrider progesteronets effekter på bröstceller, vilket ökar risken för bröstcancer57.

I den här studien presenterade vi det möjliga sambandet mellan risken för lokalrecidiv och rs3209896 AG-varianten i AKR1C3. AKR1C3 är ett fas I-läkemedelsmetaboliserande enzym som är inblandat i läkemedelsresistens mot kemoterapeutika, inklusive doxorubicin58. Det spelar en viktig roll i deaktiveringen av doxorubicin till doxorubicinol, en mindre aktiv metabolit59. Polymorfismer i AKR1C3 har studerats som riskfaktorer för lung-, prostata60 , lymfom61 och blåscancer62. Det finns också rapporter om AKR1C3-variationens roll för risken för sjukdomsprogression och dödlighet vid B-cells non-Hodgkin lymfom63 samt för moduleringen av behandlingstoxicitet och överlevnadstid hos bröstcancerpatienter58. Inverkan av rs3209896-polymorfismen på cancerrisk och kemoterapisvar beaktades dock endast i två tidigare studier, men utan framgång. I den första har asiatiska bröstcancerpatienter som behandlades med doxorubicininnehållande kemoterapi inte visat något samband mellan rs3209896 AG AKR1C3 med kemotoxicitet, PFS och OS58. I den andra studien har genetiska analyser av AKR1C3-genen hos modern och avkomman inte visat att rs3209896 AKR1C3 har något samband med leukemirisken hos barn61. I vår studie fanns däremot en genetisk-klinisk koppling när det gäller utfallet hos bröstcancerpatienter som behandlades med doxorubicininnehållande FAC-regim. Tidigare studier föreslog att AKR1C3 tillhör familjen av progesteronrelaterade gener som är involverade i prereceptormetabolismen av progesteron och trodde att den var en svagare aktivator av PGR64. Med tanke på dessa uppgifter betonar våra resultat ytterligare den kliniska betydelsen av progesteronsignalvägar. En studie av Reding et al. visade att variationen i generna AKR1C2 och AKR1C3 kan öka risken för bröstcancer hos kvinnor som har använt östrogen-progesteronbehandling65. En förmodad roll i bröstcancer baserad på AKR1C-enzymerna som metaboliserar progesteron till ett 4-pregnene beskrevs av Ji et al. Dessa författare spekulerade i att förlust av AKR1C1 och AKR1C2, men inte AKR1C3 i bröstcancer, resulterade i minskad katabolism av progesteron, vilket i kombination med ökat PR-uttryck kan förstärka progesteronsignalering genom dess kärnreceptorer64.

I vår studie hade bärarna av rs291593 CC DPYD högre risk för sjukdomsåterfall. DPYD kataboliserar 5-fluorouracil (5-FU), som vanligen används för behandling av solida karcinom66,67,68, och är också en komponent i FAC-regimen. En minskning av enzymaktiviteten kan leda till en ökning av halveringstiden för 5-FU och en ökad risk för dosberoende toxicitet67,68,69,70. SNP rs291593 CC DPYD beskrevs i studien av Kim et al. som fokuserade på allelfördelningen hos 150 koreanska försökspersoner68. Tyvärr finns det inga litteraturuppgifter om effekten av rs291593 DPYD och korrelation med överlevnad och behandlingssvar.

Sist, i vår analyserade patientgrupp korrelerade polymorfismen rs1054899 AG/AA ALDH5A1 med sämre svar på FAC-kemoterapi. ALDH5A1 är en komponent i cyklofosfamidens metaboliska väg. Brist på detta enzym är en sällsynt autosomalt recessiv neurologisk sjukdom där en allvarlig genmutationsrelaterad enzymdefekt i GABA-nedbrytningsvägen orsakar en konsekutiv förhöjning av både GABA och gamma-hydroxibärsyra (GHB)71,72,73,74,75. Förutom de neurotransmittoriska vägarna deltar ALDH5A1, tillsammans med ALDH1A1 och 3A1, i omvandlingen av cyklofosfamid och styr avgiftningen av aldofosfamid till inaktiv karboxyfosfamid76. Det är allmänt accepterat att interindividuella skillnader i bildandet av metaboliter av cyklofosfamid kan bero på polymorfismer i gener som katalyserar metaboliska reaktioner samt på förändringar i deras uttryck77. Även om det saknas uppgifter om den exakta effekten av ALDH5A1:s regulatoriska 3′UTR-variation på cyklofosfamidaktiviteten, finns det rapporter som tyder på ett samband mellan enzymuttryck och behandlingsprognos. Gruppen Tian rapporterade att lågt ALDH5A1-uttryck är en utmärkt prediktiv faktor för dålig prognos i äggstockscancer (OC) och kan spela en avgörande roll i äggstockscancers progression. Det positiva sambandet mellan uttrycket av ALDH5A1 och prognos hittades i tidiga och avancerade stadier av äggstockscancerpatienter. I graderna II/III av äggstockscancer var en hög mRNA-nivå av ALDH5A1 associerad med förbättrad OS78. Studier på kinesiska epilepsipatienter bekräftade att rs1054899 i ALDH5A1-genen kan spela en roll för farmakokinetiken för valproinsyra (VPA) med antikonvulsiva egenskaper79.

I våra analyser var den förkortade OS och PFS och den höga risken för död och progression resultatet av avancerad sjukdom – tumörstorlek över 20 mm i största dimension (dvs. T-komponent större än T1), infiltrerade regionala lymfkörtlar (dvs. N-komponent annan än N0) och förekomst av fjärrmetastaser (M1). Dessa observationer stämmer överens med den traditionella uppfattningen om bröstcancers stegvisa utveckling, från små, ännu inte spridda tumörer, till större, mer aggressiva tumörer80. Tumörstorleken (T-komponenten) anses vara en av de mest avgörande faktorerna för svaret på behandling. I studien av Goorts et al.81 var den kliniska tumörstorleken (cT) den starkaste prediktoren för att uppnå patologiskt fullständigt svar (pCR), vilket ses som avsaknad av kvarvarande cancer, i gruppen bröstcancerpatienter efter neoadjuvant kemoterapi. I den här studien hade högre cT-stadier starka, signifikant lägre pCR-frekvenser, oberoende av grad och progesteron-, östrogenreceptor- och HER2-status. Även den senaste, åttonde upplagan av Cancer Staging Manual82 bekräftar att hela TNM-stadiesystemet för bröstcancer är en uppskattning av den totala tumörvolymen, beskriven av den maximala dimensionen av tumörmassan, utan att inkludera ytterligare små satellithärdar som omger huvudtumören83.

Närvaron av regionala lymfkörtelmetastaser är en annan erkänd faktor som ger sämre prognos hos bröstcancerpatienter. Enligt de senaste riktlinjerna görs klassificeringen av lymfkörtlar utifrån storleken på den största tumörförekomsten, och summan av infiltrerade lymfkörtlar resulterar i det slutliga N-värdet82. Generellt sett avspeglas omfattningen av involverade noder i försämrad patientprognos, vilket ses – bland annat – i minskad överlevnadstid84. På samma sätt är närvaron, lokaliseringen och omfattningen av fjärrmetastaser otvetydigt ansvariga för en dålig prognos, och uppskattningsvis 90 % av bröstcancerrelaterade dödsfall beror på metastatisk spridning85. En sådan drastisk korrelation sågs även i våra analyser, där förekomsten av fjärrmetastaser var den starkaste, även statistiskt sett, överlevnadsreducerande faktorn. Denna situation tycks återspegla diskrepansen mellan primära och sekundära tumörer när det gäller de kliniska och biologiska egenskaper som förändrar behandlingssvaret mellan dessa platser. Det finns också komplicerade mönster som kopplar samman den metastatiska spridningen med den primära massans läge, patienternas ålder och även med den oförutsedda effekten av kirurgiska ingrepp på den huvudsakliga tumörmassan, vilket kan öka tillväxten av vilande mikrometastaser i olika organ85.

I vår studie var bröstcancerns negativa status för progesteronreceptor avgörande för hög risk för återfall, kortare TFFS och bristande svar på behandling. Statusen för PR, östrogenreceptorer (ER) är bland de biologiska faktorer, bortsett från HER2-uttryck och grad, som hade införlivats i bröstcancersystemets stadieindelning. Målet med detta tillvägagångssätt var att kombinera den senaste biologiska kunskapen med aktuell klinisk forskning i hopp om att fastställa enkla men exakta riktlinjer för stadieindelning som definierar prognosen med största möjliga precision86. Bristen på progesteronreceptoruttryck i bröstcancer har under de senaste åren upprepade gånger rapporterats som en faktor för dåligt behandlingsresultat, vilket stämmer överens med våra resultat. I Purdie m.fl. arbete hade gruppen PR-negativa patienter, även de undergrupper som annars skulle ha en god prognos – dvs. ER-positiva och utan lymfkörtelinfiltration – signifikant förkortat den femåriga bröstcancerspecifika överlevnaden, med eller utan tillämpning av kemoterapi87. I det citerade arbetet var PR-uttrycket den oberoende prognostiska faktorn, starkare än ER-status. Liknande resultat kom från studien av van Mackelenbergh et al. där ER-positiv/PR-negativ bröstcancer visade ett bättre initialt svar på behandling, även om den långsiktiga överlevnaden efter neoadjuvant kemoterapi i slutändan hade minskat betydligt88. Komplexiteten i hormonreceptorstatusens inverkan på behandlingsresultatet kan bero på de ömsesidiga mekanismer som finns mellan östrogen- och progesteronreceptorer. När PR saknas rekryterar östrogenreceptorn specifika kofaktorer och binder till östrogenresponselement i kromatin. Resultatet är aktivering av vägar som leder till cellproliferation89. En sådan korsverkan illustrerades i arbetet av Mohammed et al.90, som påpekade att i bröstcancer modulerar PR ER-beteendet, och dess uttryck kan ses som en markör för ER-funktionen.

Analyserna av genetiska och kliniska faktorer skulle kunna vara användbara i försöket att etablera komplexa kombinerade genetisk-kliniska modeller för patienternas förval i mer enhetliga grupper med liknande prognos med avseende på död, sjukdomsprogression, recidiv, utveckling av metaskronisk bröstcancer och övergripande behandlingssvar. För att göra detta utförde vi kumulativa analyser och valde ut de patientgrupper med den till synes sämsta prognosen, som bar på det högsta antalet ogynnsamma faktorer i en viss miljö. För varje analys pekade den kliniska komponenten på sjukdomens framskridande. Bilden kompletterades ytterligare genom tillägg av genetiska modifierare. På grund av den ofta förekommande bristen på uppgifter om den studerade genetiska variantens exakta inverkan på gen- eller proteinfunktionen måste varje tolkning av kumulativa modeller göras med stor försiktighet. Icke desto mindre var OS och den högsta risken för dödsfall det uppenbara resultatet av avancerade TNM-stadier, men förekomsten av två varianter i doxorubicintransportören SLC22A16 i denna modell understryker vikten av optimalt läkemedelsinflöde till cellerna. Dessutom verkar aktiviteten hos den viktigaste avgiftningsbrytaren NR1/2 i OS-modellen vara den aktör som förmedlar dödsrisken. Vi kan anta att det sämre behandlingssvaret i detta avseende kan vara en återspegling av överaktiva avgiftningsvägar för något av FAC-läkemedlen, vilket minskar läkemedlens terapeutiska koncentration. Det bör noteras, att styrkan i denna modell förstärks ytterligare av avsaknaden av dödsfall i gruppen av icke-bärare av högriskfaktorer.

Gruppen med den sämsta prognosen när det gäller cancerutveckling kännetecknades också av sjukdomens framskridande (metastaser) och polymorf variant i doxorubicinimportörgenen SLC22A16. I denna modell kompletterades dock bilden av förekomsten av två SNPs i progesteronreceptorgenen. Den ”dubbla träffen” som sådan, på samma sätt som för SLC22A16 i OS-analysen, pekar på sambanden mellan fysiologiska, metaboliska och signalvägar för progesteron och bröstcancercellernas metastatiska förmåga samt återupplivandet av vilande mikrometastaser. Progesteronsignalvägarna, som ses som den negativa PR-receptorstatusen i cancerceller, framstod också som en komponent i det värsta scenariot i analysen av recidivfri överlevnad. I denna situation var dock den höga risken för återfall samtidigt beroende av modifieringen i 5-fluorouracilkatabolisten DPYD samt i AKR1C3, en komponent i både doxorubicin- och progesteronmetaboliska mekanismer. Detta resultat understryker återigen betydelsen av progesteronsignalering och aktiviteten hos avgiftningsmaskineriet, som säkerställer den optimala terapeutiska läkemedelskoncentrationen.

Såvitt vi vet är detta den första studien som utvärderar det prognostiska värdet av 3′UTR-polymorfismer hos ADME-gener i samband med det totala behandlingssvaret vid bröstcancer. De kliniska bestämningsfaktorerna som högriskfaktorer dominerade dock de genetiska faktorerna i denna analys. Föga förvånande visade resultaten att PR-tumörnegativ status, tillsammans med avsaknaden av kirurgiska ingrepp, som i sin tur är en direkt följd av patientens dåliga tillstånd, är förutsägelser för negativa händelser som död, progression, återfall och utveckling av en annan bröstcancer. Den enda genetiska komponenten i denna modell, en variant i ALDH5A1, pekar på de kataboliska mekanismerna för cyklofosfamid. Dessutom stöds styrkan i denna modell av resultaten av TFFS-analysen. Även om det ursprungliga behandlingssvaret i detta arbete uppskattades inom 10 månader sedan kemoterapin påbörjades, gjorde den erhållna uppdelningen av patienterna i grupper med avseende på antalet ogynnsamma faktorer det möjligt att förutsäga den långsiktiga överlevnaden. Efter denna analys rapporterar vi den exempellösa, över 14-faldiga minskningen av medianöverlevnaden mellan grupperna med bästa och sämsta prognos.

Slutsatsen är att de normala germina varianter som är vanligt förekommande i befolkningen är viktiga faktorer som bestämmer svaret på behandling. Studien visar att polymorfismer är en oberoende prognostisk prediktionsfaktor för överlevnad hos kvinnor med bröstcancer. Dessutom observerade vi effekten av ackumulering av flera ogynnsamma genetiska och kliniska faktorer på dålig överlevnadsprognos och övergripande behandlingssvar. Resultaten tyder på att germina polymorfismer påverkar doxorubicins farmakokinetik. Vår studie visar de starkaste sambanden mellan total överlevnad, progressionsfri överlevnad och genetiska polymorfismer i SLC22A16-genen som är engagerad i doxorubicintransport. Dessutom har SNP i AKR1C3, en gen som är involverad i doxorubicinmetabolismvägen, en effekt på recidivfri överlevnad. Sammanfattningsvis ökar förekomsten av negativa genetiska och kliniska faktorer risken för dåligt utfall av behandlingssvar hos polska kvinnor med bröstcancer som behandlades med FAC-regim. Denna studie antyder att urval av patienter baserat på de kumulativa modellerna av ogynnsamma faktorer kan vara till hjälp för att förutsäga prognosen när det gäller död, progression eller recurrency.